2019年2月新文 10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 僅需4個(gè)樣本?。。?/h1>

發(fā)稿時(shí)間：2019-02-20來(lái)源：天昊生物

Cell Reports: The Neonatal and Adult Human Testis Defined at the Single-Cell Level

研究背景

精子形成過(guò)程更多地在嚙齒類動(dòng)物中被研究，而對(duì)人類精子形成的過(guò)程知之甚少，并且兩者之間存在顯著不同。在人類的相關(guān)研究中，精原干細(xì)胞（SSCs）是一個(gè)焦點(diǎn)，因?yàn)槠湓谂R床上可能被用于治療不育；另外一個(gè)較活躍的領(lǐng)域則是鑒別標(biāo)記SSCs的蛋白marker和形態(tài)學(xué)研究。然而很多這些marker并不能鑒別未分化的精原細(xì)胞（SPG），也不能區(qū)分分化中的SPG。當(dāng)前的SPG單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-Seq）文章主要排除了其它睪丸細(xì)胞進(jìn)行的分析，或多或少存在著一定的局限性¹，而這篇文章理論上分析了人類睪丸樣本中所有的細(xì)胞類型²。

主要內(nèi)容

1. scRNA-Seq揭示成人睪丸樣本中SPG細(xì)胞亞群

利用10X Genomics Chromium Single Cell Kit [v2 chemistry]進(jìn)行文庫(kù)制備，scRNA-Seq分析了兩個(gè)能生育個(gè)體的睪丸細(xì)胞樣本（37y和42y），質(zhì)控后共18723個(gè)細(xì)胞用于后續(xù)分析。其中多種已知的睪丸細(xì)胞類型被發(fā)現(xiàn)，包括SPG和SPC（精母細(xì)胞）等（圖1A），而進(jìn)一步對(duì)SPG細(xì)胞亞群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其由4種不同的細(xì)胞群體組成，包括SSC-1, SSC-2,早期分化的SPG及分化的SPG（圖1B）。SSC-1和SSC-2中多數(shù)細(xì)胞有明顯的細(xì)胞周期基因表達(dá)特征，表明它們處于G0或G1期，而較少的細(xì)胞處于S期或G2/M期，這也說(shuō)明多數(shù)SSC-1和SSC-2細(xì)胞并未增殖或經(jīng)歷緩慢增殖（圖1C-D）。為了探索這四種SPG亞群之間發(fā)育關(guān)系，基于差異表達(dá)的基因進(jìn)行了Monocle擬時(shí)軌跡分析，將單個(gè)細(xì)胞沿發(fā)育軌跡進(jìn)行排列，結(jié)果表明這些細(xì)胞亞群按如下發(fā)育順序：SSC-1→SSC-2→Early diff-SPG→Diff-SPG（圖1E）。

圖1成人睪丸樣本中SPG細(xì)胞亞群

2. 過(guò)渡細(xì)胞及3種未分化SPG狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)

Monocle分析發(fā)現(xiàn)在擬時(shí)軌跡線性路徑中存在一類分支細(xì)胞（圖1E頂部），這類Monocle定義的細(xì)胞又具有三類不同的細(xì)胞亞群的特征—SSC-1, SSC-2和早期分化的SPG，聚類分析也能將這些細(xì)胞聚在一起，繼而推測(cè)這些細(xì)胞可能是由一類過(guò)渡細(xì)胞（Transition Cells, TCs）組成，將SSC和分化的SPG階段連接起來(lái)（圖2A）。而支持這一假設(shè)的依據(jù)則為marker基因的表達(dá)在早期和晚期細(xì)胞中均有出現(xiàn)，而TCs中也共表達(dá)了SSC-1和SSC-2中的marker基因（圖2A下，2B），在分析過(guò)程中也排除了可能由cell doublets帶來(lái)的影響。

在SSC-1中發(fā)現(xiàn)一些基因表達(dá)在明顯不同的區(qū)域（zones），可能是在SSC-1亞群中存在不同的細(xì)胞狀態(tài)（圖1B底部），因此僅對(duì)SSC-1細(xì)胞進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示了三類亞群的存在—SSC-1A, SSC-1B和SSC-1C（圖2C-D），三類細(xì)胞亞群選擇性表達(dá)特定的marker基因（圖2E）。擬時(shí)軌跡分析也發(fā)現(xiàn)這三類細(xì)胞或單獨(dú)，或與其它細(xì)胞聯(lián)合，其中SSC-1B細(xì)胞富集了最多的SSC（圖2F）。

圖2 未分化SPG亞群

3. 候選的SSC蛋白marker的鑒別

鑒別人的SSC蛋白marker對(duì)于人的SSC研究至關(guān)重要，因此利用IHC和IF的方法分別鑒定未分化SPG的marker（圖3A-C），結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)PIWIL4和LPPR3能夠標(biāo)記一類高度特異性的未分化SPG亞群，具有SSC的特征。

圖3 未分化SPG marker鑒定

4. 新生兒睪丸樣本中的細(xì)胞亞群

為了評(píng)估成人睪丸原始未分化SPG細(xì)胞的發(fā)育起源，研究人員又利用scRNA-Seq分析了新生兒睪丸樣本，質(zhì)控后來(lái)源于兩位新生兒（2d和7d）睪丸的14862個(gè)細(xì)胞被分析?；谝阎?span>marker基因通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)了5種細(xì)胞亞群（圖4A）。為了進(jìn)一步闡明新生兒睪丸中生殖細(xì)胞（germ cells）的本質(zhì)，僅對(duì)germ cells進(jìn)行聚類分析，基于一些marker基因又發(fā)現(xiàn)了2種新生兒germ cells亞群（圖4B），即PGCL和PreSPG（PreSPG-1和PreSPG-2）。

為了進(jìn)一步揭示這三類新生兒germ cell亞群，將已發(fā)表的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)納入分析，數(shù)據(jù)來(lái)源于4w-19w胎兒的PGCs ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA ³。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)所有5個(gè)妊娠期的PGCs基因的平均表達(dá)水平與PGCL亞群相近（圖4C）。進(jìn)一步探尋PGCs和germ cell數(shù)據(jù)間的發(fā)育關(guān)系，再進(jìn)行Monocle軌跡分析，基于marker基因發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞亞群按如下發(fā)育順序：PGC→PGCL→PreSPGs（圖4D）。

5. PGCL蛋白marker的鑒別

數(shù)據(jù)表明PGCL亞群在胚胎PGCs和成人SPG間是一個(gè)重要的過(guò)渡階段，利用IHC方法對(duì)PGCLs中差異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定以尋找特定的蛋白marker，發(fā)現(xiàn)3種蛋白，ETV4, PIM2和POU5F1選擇性標(biāo)記這些細(xì)胞（圖4E）。

6. 新生兒germ cell發(fā)展到近成人SSC的狀態(tài)

為了確定新生兒germ cell和成人SSC之間的關(guān)系，對(duì)兩者進(jìn)行合并聚類分析，其中SSC-1細(xì)胞形成了大的細(xì)胞群，囊括了PreSPG-1和PreSPG-2（圖4F）。擬時(shí)軌跡較好地驗(yàn)證了PGCL細(xì)胞是最未分化的新生兒細(xì)胞亞群，其它依次為PreSPG-2, PreSPG-1和SSC-1（圖4G）。

圖4新生兒睪丸樣本中的細(xì)胞亞群

7. 體細(xì)胞出現(xiàn)在發(fā)育的和成人的睪丸中

為了更精確的確定新生兒和成人睪丸中的體細(xì)胞，需要僅對(duì)新生兒和成人睪丸中的體細(xì)胞進(jìn)行聚類分析（圖5A-B），細(xì)胞周期基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞幾乎沒(méi)有處于細(xì)胞周期的更新中（圖5C）。類似于以上分析步驟，對(duì)這些體細(xì)胞群也進(jìn)行了marker基因分析和擬時(shí)軌跡分析（圖5D-F）。

圖5 睪丸樣本中體細(xì)胞亞群分析

結(jié)論

男性生殖細(xì)胞發(fā)育是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，從胚胎生殖細(xì)胞到PGCs，再通過(guò)一系列狀態(tài)的改變，包括增殖、凋亡和分化形成SSCs，SSCs通過(guò)自我更新和分化，繼而生成精子。生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程模型如圖6所示。

圖6 男性配子發(fā)育過(guò)程模型圖

參考文獻(xiàn)：

1.  Guo, J. et al. Chromatin and Single-Cell RNA-Seq Profiling Reveal Dynamic Signaling and Metabolic Transitions during Human Spermatogonial Stem Cell Development. Cell Stem Cell 21, 533-546 e6 (2017).

2.  Sohni, A. et al. The Neonatal and Adult Human Testis Defined at the Single-Cell Level. Cell Rep 26, 1501-1517 e4 (2019).

3.  Guo, F. et al. The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells. Cell 161, 1437-52 (2015).