Peer J：整合高通量絕對(duì)豐度定量方法解析土壤細(xì)菌群落及動(dòng)態(tài)

發(fā)稿時(shí)間：2019-02-15來源：天昊生物

英文題目: Assessing soil bacterial community and dynamics by integrated high-throughput absolute abundance quantification

中文題目：整合高通量絕對(duì)豐度定量方法解析土壤細(xì)菌群落及動(dòng)態(tài)

期刊名：Peer J

發(fā)表時(shí)間：2018年

研究摘要:

高通量測(cè)序方法，結(jié)合物種分類和其相對(duì)豐度信息，對(duì)微生物生態(tài)學(xué)研究具有顯著的促進(jìn)作用。然而，相對(duì)豐度并不能反映微生物群落的真實(shí)數(shù)量和類群間的樣本差異。在這項(xiàng)研究中，我們改進(jìn)并應(yīng)用了一種高通量絕對(duì)豐度定量方法（iHAAQ），這種方法將相對(duì)豐度（高通量測(cè)序）和細(xì)菌總數(shù)（定量PCR）結(jié)合在一起從而對(duì)土壤細(xì)菌群落進(jìn)行定量分析。通過內(nèi)參菌株EDL933和實(shí)驗(yàn)室菌株WG5驗(yàn)證了iHAAQ方法。iHAAQ法在土壤菲（PHE）生物降解研究中的應(yīng)用表明，對(duì)某些細(xì)菌類群而言，相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的變化是一致的，而其它細(xì)菌類群相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的變化則相反。隨著微生物活性抑制劑（疊氮化鈉）的加入，土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群（包括Bacillus, Flavobacterium, Paenibacillus）的絕對(duì)豐度顯著降低，但在培養(yǎng)28天后相對(duì)豐度增加。結(jié)果表明，使用絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度的iHAAQ方法比常規(guī)擴(kuò)增子測(cè)序得到的相對(duì)豐度更能真實(shí)反映土壤細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化。

研究背景:

細(xì)菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。據(jù)估計(jì)，地球上有4-6×10³⁰個(gè)原核生物細(xì)胞，土壤中就有2.6×10³⁰個(gè)，因此土壤具有地球上最豐富多樣的細(xì)胞生命形式。關(guān)于土壤細(xì)菌個(gè)體及其群落已經(jīng)研究了多年，但仍有85-99%以上的細(xì)菌不能在培養(yǎng)基中分離和生長(zhǎng)，因此關(guān)于土壤有多少細(xì)菌（絕對(duì)和相對(duì)豐度）和它們是誰(shuí)（物種種類）仍是一個(gè)未知問題，在過去的幾十年里，科學(xué)家們?cè)噲D回答這些問題，傳統(tǒng)的平板菌落計(jì)數(shù)法可同時(shí)獲得土壤細(xì)菌絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度信息，但由于可培養(yǎng)菌的百分比較低，因此該方法存在局限性。目前許多其它方法已被用于探索土壤細(xì)菌群落的絕對(duì)或相對(duì)豐度，例如Brookes等人試圖通過測(cè)量土壤中的微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)來估算總微生物豐度。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和特定靶基因的驗(yàn)證，定量PCR也成為一種測(cè)量土壤中微生物絕對(duì)豐度有力而準(zhǔn)確的技術(shù)。各種生物標(biāo)志物和分子方法對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究也有一定的參考價(jià)值，這些方法包括磷脂脂肪酸（PLFAS）、聚合酶鏈反應(yīng)變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）、克隆文庫(kù)、催化報(bào)告沉積熒光原位雜交（CALD-FISH）、微流控qPCR等。特別是高通量測(cè)序，該方法開創(chuàng)了微生物學(xué)的新紀(jì)元，經(jīng)微生物模擬群落和多項(xiàng)研究證實(shí)，該方法能以前所未有的信息量揭示土壤細(xì)菌群落的相對(duì)豐度和種類。由于高通量測(cè)序技術(shù)可以獲得相對(duì)豐度信息，因此，已經(jīng)有數(shù)個(gè)研究將高通量測(cè)序技術(shù)與總微生物的絕對(duì)定量方法相結(jié)合從而可以得到微生物群落變化更多信息。例如，將流式細(xì)胞儀（FCM）、三磷酸腺苷（ATP）、異養(yǎng)平板計(jì)數(shù)（HPC）、qPCR、PLFAs、MBC等方法結(jié)合，對(duì)總微生物的絕對(duì)豐度進(jìn)行定量分析。例如，Prest等人結(jié)合FCM和16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序，成功揭示了飲用水中細(xì)菌群落的變化。Dannemiller等人結(jié)合qPCR和高通量測(cè)序方法對(duì)真菌氣溶膠種群進(jìn)行了定量比較。最近，張等人結(jié)合ATP、qPCR、PLFAs和高通量測(cè)序技術(shù)得到的結(jié)果，對(duì)兩個(gè)不同位置的土壤細(xì)菌群落進(jìn)行了調(diào)查。但是到目前為止，還沒有研究將總微生物的絕對(duì)量化方法和高通量測(cè)序數(shù)據(jù)相結(jié)合來解析土壤細(xì)菌群落，這是因?yàn)橥寥辣绕渌h(huán)境更復(fù)雜。如前所述，qPCR法是一種精確測(cè)定基因絕對(duì)豐度的方法，而高通量測(cè)序是測(cè)定細(xì)菌群落相對(duì)豐度的主要方法，因此，本研究結(jié)合qPCR和高通量測(cè)序技術(shù)，提出了一種定量土壤細(xì)菌生態(tài)學(xué)的整合高通量絕對(duì)豐度定量方法(iHAAQ)。iHAAQ方法的準(zhǔn)確性通過內(nèi)參菌株大腸桿菌O157:H7菌株EDL933進(jìn)行了驗(yàn)證，這個(gè)內(nèi)參菌株可以很容易地與土壤中的本底細(xì)菌進(jìn)行分類和區(qū)分，此外，由于內(nèi)參菌株含有鞭毛生物合成蛋白flic基因，因此可以用qPCR方法進(jìn)行絕對(duì)定量。

研究方法：

細(xì)菌菌株、培養(yǎng)基和化學(xué)品：

將菌株EDL933在37℃搖床（250rpm）上培養(yǎng)后， 4℃離心（6000×g，10 min）收集，用無菌去離子水洗滌3次。將細(xì)胞顆粒重新懸浮在無菌去離子水中，使細(xì)胞濃度接近2.1×10 ¹¹ cfu/ml，用無菌去離子水稀釋菌株EDL933梯度濃度至2.1×10¹¹～2.1×10⁶ cfu/ml，并加入土壤樣品中。從江蘇省多環(huán)芳烴PHE污染土壤中分離得到了一株具有較高降解PHE能力的Massilia sp.WG5菌株（微生物降解是去除土壤PHE污染的最主要途徑），在LB培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)后，在4℃（6000×g，10分鐘）離心收獲菌株WG5，并用無菌去離子水洗滌三次，然后將細(xì)胞顆粒重新懸浮至D 600nm 1.0（約1.5×10 ⁸ cfu/ml）備用。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置和DNA提?。?/span>

土壤是從中國(guó)福建省一家鋼廠附近的表層（0-20厘米）收集。使用冰袋冷卻器將三個(gè)復(fù)合土壤樣品送至實(shí)驗(yàn)室，然后，將土壤過篩（2mm）并儲(chǔ)存在4℃以供使用。試驗(yàn)包括10種處理：對(duì)照（僅土壤），命名為Cont；添加6種菌株EDL933濃度的土壤（10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴ cfu/g干重土壤），命名為E9、E8、E7、E6、E5和E4；添加PHE的土壤（100 μ g/g干重土壤），命名為P；添加PHE（100 μ g/g干重土壤）和WG5菌株（1.00×10 ⁷ CFU/g干重土壤）的土壤，命名為W；添加PHE（100 μ g/g干重土壤）和疊氮化鈉（NaN3，0.1%，w/w）的土壤,，命名為S, 添加疊氮化鈉目的是抑制微生物的天然活性。在組別E9、E8、E7、E6、E5、E4時(shí)，將梯度濃度分別為2.1×10 ¹¹-2.1×10 ⁶ cfu/ml的1.0ml菌株EDL933添加到每個(gè)土壤樣品（30 g凍干基）中。使用E9、E8、E7、E6、E5、E4和Cont建立了iHAAQ方法，利用P、W和S揭示PHE生物降解過程中土壤細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化。

將30 g（凍干基）土壤放入100 ml燒瓶中，每個(gè)處理制備三份樣品。添加無菌去離子水，將所有處理過的土壤徹底混合兩小時(shí)，并將土壤濕度調(diào)整為100%的田間容量（土壤含水量為-33 kPa）。立即從每個(gè)燒瓶中取樣10克（凍干基）土壤，此外，所有處理P、W和S的燒瓶在28±1°C的黑暗中培養(yǎng)，每周在干凈的工作臺(tái)上通氣30分鐘，添加無菌去離子水以補(bǔ)償培養(yǎng)過程中的土壤水分損失, 并保持樣品的恒定土壤水分含量，培養(yǎng)28天后，從處理P、W和S的每個(gè)燒瓶中抽取10克（凍干基）土壤進(jìn)行DNA提取。

從燒瓶中采集的所有土壤樣品立即冷凍并儲(chǔ)存在?80 °C冰箱中。使用MoBio PowerSoil DNA Isolation kit提取每份采集樣品, 提取的DNA在qPCR分析前存儲(chǔ)在同一個(gè)?80°C冷凍室中。

定量PCR分析：

用Steponeplus Real-Time PCR儀器對(duì)提取的DNA特異基因進(jìn)行qPCR分析：選擇341F-534R（V3）、520F-802R（V4）這兩對(duì)引物分別檢測(cè)總細(xì)菌16s rRNA基因拷貝數(shù)。為了檢測(cè)菌株EDL933絕對(duì)豐度，從其染色體中選擇了fliC基因進(jìn)行qPCR檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線是用含有16S rRNA和flic基因片段的質(zhì)粒10倍梯度稀釋得到的，從16s rRNA和flic基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出所有基因拷貝數(shù)。

高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)處理：

用V4區(qū)引物（520F和802R）擴(kuò)增Cont、E9-E4、P、W和S處理組的細(xì)菌群落，然后用Illumina miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。使用QIIME軟件（版本1.7.0）對(duì)原始序列讀取進(jìn)行質(zhì)量控制, 如果移動(dòng)5bps窗口中的平均質(zhì)量低于Q20，長(zhǎng)度小于150bps，且條形碼不明確，則刪除序列。配對(duì)的末端序列用相同的指數(shù)拼接，重疊不小于10bps，使用FLASH沒有錯(cuò)配。經(jīng)過質(zhì)量過濾后，具有97%相似性的序列使用UCLUST進(jìn)行聚類，分類為OTUs。然后，使用RDP分類器對(duì)OTUs進(jìn)行分類，以匹配Silva數(shù)據(jù)庫(kù)。

iHAAQ法對(duì)土壤細(xì)菌及其群落進(jìn)行絕對(duì)定量：

將總細(xì)菌數(shù)（qPCR得到的總細(xì)菌16s rRNA基因拷貝數(shù)）和高通量測(cè)序得到的相對(duì)豐度相乘可以計(jì)算出土壤細(xì)菌群落中各門或?qū)俚慕^對(duì)豐度（圖1）。基于16S rRNA基因V3和V4得到的總細(xì)菌數(shù)和高通量測(cè)序得到的相對(duì)豐度計(jì)算出內(nèi)參菌株EDL933的絕對(duì)豐度（ESCH-V3和ESCH-V4）。由于不同細(xì)菌基因組中16S rRNA基因的拷貝數(shù)不同，本研究使用了EDL933菌株，其基因組中16S rRNA基因具有7個(gè)拷貝，fliC基因具有1個(gè)拷貝。為了驗(yàn)證iHAAQ方法，在提取DNA前，將內(nèi)參考菌株（IRS）引入土壤中，并用iHAAQ和qPCR方法進(jìn)行測(cè)定，然后對(duì)iHAAQ法得到的內(nèi)參菌株絕對(duì)豐度（ESCH-V3和ESCH-V4）和qPCR得到的內(nèi)參菌株7×flic基因拷貝數(shù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行線性回歸分析，將這兩個(gè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析后從而驗(yàn)證了iHAAQ方法的有效性。

圖1 iHAAQ方法及其驗(yàn)證程序的示意圖。

研究結(jié)果：

qPCR法測(cè)定菌株EDL933和細(xì)菌總數(shù)

對(duì)于V3和V4區(qū)，本底細(xì)菌總數(shù)（16S rRNA基因拷貝數(shù)）分別為3.53×10⁹±1.23×10⁸和5.82×10⁹±3.29×10⁸拷貝（每g干重土）。對(duì)于V3和V4區(qū)，E9-E4處理的細(xì)菌總數(shù)分別為7.00×10¹⁰-3.53×10⁹和7.23×10¹⁰-5.82×10⁹拷貝（每g干重土）。E9和E8中V3和V4區(qū)域的總細(xì)菌量顯著高于其它處理中的細(xì)菌總量（圖S1）。與本底細(xì)菌總數(shù)（~10⁹拷貝/每g干重土）相比，添加菌株EDL933在處理E4-E7中對(duì)細(xì)菌總數(shù)僅有輕微影響（圖S1）。

圖S1 不同處理土壤中細(xì)菌16S rRNA基因的拷貝數(shù)

建立了fliC基因在3.60×10¹～3.60×10⁹拷貝數(shù)范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在E9～E4處理中，fliC基因的Ct值（13.73±0.05～29.66±0.06）均在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。fliC基因拷貝和添加的EDL933菌株濃度（數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)10）與線性模型（R²=0.999）吻合得很好（圖S3），無論有無截距，其斜率均接近1，說明提取的土壤DNA中對(duì)fliC基因進(jìn)行定量可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)土壤中EDL993菌株的濃度。

圖S3 添加的內(nèi)參菌株EDL933濃度和qPCR檢測(cè)到的EDL933菌株flic基因拷貝數(shù)的線性回歸

iHAAQ方法的建立和驗(yàn)證

經(jīng)質(zhì)量篩選，共有465220條高質(zhì)量序列（每個(gè)樣本66460個(gè)序列），可分為35門。在屬水平上，在Silva數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到了內(nèi)參菌株EDL933，將其分類為志賀氏埃希菌屬。E4-E9組志賀氏埃希菌屬的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于對(duì)照組，并且當(dāng)更多的菌株EDL933添加到土壤中時(shí)，其相對(duì)豐度增加（圖2）。

圖2不同處理下內(nèi)參菌株EDL933（志賀氏埃希菌屬）的相對(duì)豐度。

E9處理組大腸桿菌志賀氏菌屬在變形桿菌門中的比例為89.76%，而對(duì)照組為0.07%，fliC基因拷貝乘以7倍后（標(biāo)記為7×fliC），除E4外，其它組總菌絕對(duì)豐度數(shù)量級(jí)與ESCH-V3和ESCH-V4相同（表1）。方差分析結(jié)果表明，除E4外，7×fliC和ESCH-V4無顯著性差異。此外， qPCR檢測(cè)到的內(nèi)標(biāo)菌株EDL933的7×fliC基因拷貝數(shù)和iHAAQ方法檢測(cè)到的ESCH-V3和ESCH-V4絕對(duì)拷貝數(shù)呈線性相關(guān)（表1，圖3），表明ESCH-V3和ESCH-V4的絕對(duì)豐度可以可靠地預(yù)測(cè)EDL933菌株的7×fliC基因拷貝（圖3），因此基于qPCR和高通量排序的iHAAQ方法可用于計(jì)算菌群絕對(duì)豐度（圖1和圖4）。

表1用qPCR（flic基因和7×flic基因）和iHAAQ方法(Esch-V3 和 Esch-V4)檢測(cè)和計(jì)算土壤中添加的內(nèi)參菌株EDL933拷貝數(shù)（每g干重土）。

圖3不同處理中qPCR檢測(cè)到的內(nèi)標(biāo)菌株EDL933的7×fliC基因拷貝數(shù)和iHAAQ方法檢測(cè)到的ESCH-V3和ESCH-V4絕對(duì)拷貝數(shù)的線性回歸

圖4不同處理中主要門的絕對(duì)豐度

iHAAQ檢測(cè)土壤細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)

從7天培養(yǎng)到28天，處理P中殘留的PHE迅速?gòu)?span>22.01降至8.44μg（每g干重土），處理W中殘留的PHE從7.53降至4.38μg（每g干重土）。與處理P和W相比，處理S含有最高的殘留PHE，并且在28天培養(yǎng)期間變化最小。按照?qǐng)D1所示的程序，采用iHAAQ方法對(duì)土壤細(xì)菌群落在P、W和組別中的動(dòng)態(tài)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。P、W處理的細(xì)菌總數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增加，S處理的細(xì)菌總數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間增加而減少（圖S4）。

圖S4 不同土壤樣品總細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)，P、S和W處理分別代表添加了PHE、NaN3和菌株WG5的土壤。

樣本主要有17個(gè)細(xì)菌門，相對(duì)豐度的動(dòng)態(tài)反映了培養(yǎng)過程中土壤細(xì)菌組成的變化（圖S5）?？偟膩碚f，半數(shù)以上的門相對(duì)豐度隨培養(yǎng)時(shí)間增加而降低。P組的Firmicutes, Proteobacteria, Planctomycetes, Bacteroidetes, Actinobacteria分別下降5.58%、1.93%、1.59%、1.28%和1.24%；W組的Proteobacteria, Firmicutes, Verrucomicrobia分別下降9.24%、3.41%和0.93%；S組的Actinobacteria, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Proteobacteria分別減少了6.57%、4.24%、2.77%和1.40%，而S組的Firmicutes從8.53%大幅增加到25.87%，最終成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌。

圖S5 門水平不同處理培養(yǎng)過程中土壤細(xì)菌相對(duì)豐度的變化

然而相對(duì)豐度并不能提供土壤中細(xì)菌總數(shù)變化的信息。根據(jù)iHAAQ方法計(jì)算的絕對(duì)豐度，只有P組中5個(gè)門的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度同時(shí)下降，其它門的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度則都呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)（圖1，5–7）。例如，P組Proteobacteria的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的差異尤為明顯，相對(duì)豐度下降6.67%，而V3和V4區(qū)的絕對(duì)豐度分別增加42.22%和21.02%，在W和S組中也觀察到了這種相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度不一致的結(jié)果。

圖5用iHAAQ法測(cè)定的不同土壤樣品中主要門的絕對(duì)豐度

相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度之間的差異也出現(xiàn)在屬水平上（圖7）。在P組，用V3和V4區(qū)域分別觀察到135和57個(gè)屬相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度相反結(jié)果。而在W組，V3和V4區(qū)域分別有77和160個(gè)屬的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度相反結(jié)果。而在S組，V3和V4區(qū)域分別有258和245個(gè)屬的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度相反結(jié)果。在P、W組有一個(gè)共同趨勢(shì)：各屬相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，絕對(duì)豐度則呈上升趨勢(shì)。而S組則是各屬相對(duì)豐度呈增加趨勢(shì)，絕對(duì)豐度則呈降低趨勢(shì)。例如，在S組中，優(yōu)勢(shì)屬Bacillus的相對(duì)豐度從3.67%增加到13.11%（圖7），但絕對(duì)豐度下降20%以上。

用高通量測(cè)序法測(cè)定了W0樣品中添加的實(shí)驗(yàn)室WG5菌株，將其歸為Massilia屬，W0中Massilia屬的相對(duì)豐度高于P0和S0樣品。土壤在28℃孵育28天后， Massilia屬在W組土壤中的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度變化程度也不同：在第0天（W0）和第28天（W28）（圖7），Massilia屬相對(duì)豐度分別為10.71%和2.71%，下降了近四分之三（74.70%）,而W0和W28樣品Massilia屬在V3和V4區(qū)的絕對(duì)豐度則分別減少了不到三分之二（63.69%）和一半（51.84%）。

圖7處理P、W和S代表屬的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度

熱圖分析也顯示了處理過程中細(xì)菌相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度之間的差異（圖6）：基于相對(duì)豐度，將P0、W0和P28、S0樣品分為兩組，而W28和S28樣品則遠(yuǎn)離這兩組（圖6A）。然而，基于絕對(duì)豐度的聚類結(jié)果卻完全不同， P28、W28樣本聚類為同一組（圖6B），P0、W0和S0、S28樣本聚類為兩個(gè)不同的組（圖6B）。

圖6熱圖顯示了由iHAAQ方法(16S rRNA基因V4區(qū))量化的主要門相對(duì)豐度（a）和絕對(duì)豐度（b）。