Greenleaf教授最新Nature Reviews文章：染色質(zhì)可及性和調(diào)控表觀組學(xué)

發(fā)稿時(shí)間：2019-02-02來(lái)源：天昊生物

Stanford大學(xué)William Greenleaf教授，ATAC-seq領(lǐng)域開創(chuàng)者之一

個(gè)人主頁(yè)：http://greenleaf.stanford.edu/index.html

雖然名字叫“Greenleaf (綠葉)”，但是William Greenleaf教授在表觀調(diào)控研究領(lǐng)域，絕對(duì)是“紅花”級(jí)人物。自該課題組在2013年Nature Methods上發(fā)表第一篇ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin using sequencing)技術(shù)性文章(Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position)以來(lái)，有關(guān)染色質(zhì)開放程度及表觀調(diào)控相關(guān)的研究就火了起來(lái)。Greenleaf教授于2019年1月在Nature Reviews Genetics上發(fā)表了綜述性文章，系統(tǒng)總結(jié)了染色質(zhì)可及性和調(diào)控表觀組學(xué)研究進(jìn)展。

DNA的物理可接近是染色質(zhì)高度動(dòng)態(tài)過程，在建立和維持細(xì)胞特征方面發(fā)揮著重要作用?；蚪M可接近染色質(zhì)的組織形式反映了可能的物理性相互作用網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、絕緣體和染色質(zhì)結(jié)合因子共同作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這種可及性情況會(huì)隨著外部刺激和發(fā)育的變化而動(dòng)態(tài)變化。新的證據(jù)表明，可及性的穩(wěn)態(tài)維持本身是通過染色質(zhì)結(jié)合因子和核小體之間的競(jìng)爭(zhēng)相互作用來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的。在這篇綜述中，作者總結(jié)了如何檢測(cè)可接近基因組方法，并探索轉(zhuǎn)錄因子在啟動(dòng)可接近性重塑中的作用；本文目標(biāo)是闡明染色質(zhì)可及性如何詮釋基因組中的調(diào)控元件，并探討這些表觀遺傳學(xué)特征如何動(dòng)態(tài)建立并控制基因表達(dá)的。

名詞解釋：

Chromatin-binding factors: Non-histone macromolecules that bind either directly or indirectly to DNA.

Transcription factor (TF): A non-histone protein that directly binds to DNA.

Architectural proteins: Proteins that have a structural role in organizing chromatin, including linker and core histone proteins, as well as insulator proteins.

Nucleosome occupancy: The fraction of time that a particular sequence of DNA is bound by the core histone octamer.

Epigenetic canalization: A set of persistent epigenetic features (alternatively, the process of establishing this feature set) that molecularly defines a cell type and comprises a continuum of cellular states including cell cycle phases and active

tion states.

TF footprinting: High-resolution analysis of chromatin accessibility data to identify a local accessibility signature in the neighborhood of putative binding sites for a particular transcription factor (TF). This signature reflects the size and binding mechanism, as well as other biophysical properties, of a TF.

Nucleosome turnover rates: The rates at which nucleosomes disassemble at particular genomic loci; alternatively, the inverse of the nucleosome residence times.

Poised enhancers: Inactive enhancers that do not regulate gene expression but share a subset of epigenetic features commonly observed at active enhancers, including histone H3 lysine 4 monomethylation (H3K4me) and accessibility.

圖1、可接近狀態(tài)反映基因組中染色質(zhì)動(dòng)態(tài)的分布。與封閉染色質(zhì)（closed chromatin）相反，寬松染色質(zhì)（permissive chromatin）對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子來(lái)說是足夠動(dòng)態(tài)的，可以啟動(dòng)序列特異性的可及性重塑并建立開放染色質(zhì)（open chromatin）構(gòu)象。Pol II：核糖核酸聚合酶II；TF：轉(zhuǎn)錄因子。

染色質(zhì)可及性（Chromatin accessibility）是核內(nèi)大分子能夠物理接觸染色質(zhì)化DNA的程度，由核小體的占據(jù)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及阻礙DNA可及性的其他染色質(zhì)結(jié)合因子決定（圖1）。雖然可接近的基因組占總DNA序列的約2-3%，但卻含有90%以上TFs的結(jié)合區(qū)域。TFs與組蛋白和其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白動(dòng)態(tài)競(jìng)爭(zhēng)，以調(diào)節(jié)核小體占據(jù)率并促進(jìn)對(duì)局部DNA的接近。染色質(zhì)可及性反映了TF結(jié)合和遺傳位點(diǎn)總的調(diào)節(jié)潛力。這種觀點(diǎn)為追蹤決定細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子差異結(jié)合的可及性變化奠定了分析基礎(chǔ)。

檢測(cè)染色質(zhì)可及性常用方法

最近的技術(shù)進(jìn)步極大地拓寬了染色質(zhì)可及性檢測(cè)的應(yīng)用范圍，將樣本需求降低到臨床的水平，并提高了這些分析的鑒定能力，以識(shí)別單細(xì)胞和單分子分辨率下的調(diào)控結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖2、檢測(cè)染色質(zhì)可及性的主要方法。a）DNase-seq：脫氧核糖核酸酶I超敏位點(diǎn)測(cè)序(DNase I hypersensitive site sequencing)，使用內(nèi)切脫氧核糖核酸酶在可接近的染色質(zhì)內(nèi)切割DNA。內(nèi)切核酸酶在蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)切割效果被大大削弱(紅色十字表示切割阻斷)。b）ATAC-seq：轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測(cè)序（Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing），使用超活性轉(zhuǎn)座酶(Tn5)同時(shí)切割并將adaptors連接到可及DNA上并測(cè)序。c）MNase-seq：微球菌核酸酶測(cè)序(Micrococcal nuclease sequencing)，使用內(nèi)切核酸酶/外切酶MNase切割和除去可接近的DNA并測(cè)序。d）NOMe-seq：核小體定位及甲基化組測(cè)序(Nucleosome occupancy and methylome sequencing)，使用GpC甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)甲基化可接近的DNA。亞硫酸氫鹽將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶核苷酸后的DNA并測(cè)序。

DNase-seq：利用DNase切割之后測(cè)序的方法來(lái)量化基因組中DNase敏感染色質(zhì)的相對(duì)豐度?？梢允褂肐I型酶進(jìn)行單次切割后進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序的，也有使用雙次切割后選擇合適大小片段建庫(kù)測(cè)序。單次切割方法可以識(shí)別更容易接近的位置，而雙次切割工作流程更簡(jiǎn)單，可以得到更高信噪比數(shù)據(jù)（圖2a）。

ATAC-seq：利用超活性轉(zhuǎn)座酶Tn5切割染色染后測(cè)序。目前ATAC-seq已經(jīng)被廣泛采用，重要原因是該方法技術(shù)穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單快速，并且適用于臨床和初級(jí)組織等樣本有限的情況。ATAC-seq文庫(kù)通?？梢栽诓坏?小時(shí)內(nèi)可以用10000-20000個(gè)細(xì)胞（已有報(bào)道使用少至500個(gè)細(xì)胞）構(gòu)建；相比之下，DNase-seq通常需要數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞和幾天才能完成。

MNase-seq：利用微球菌核酸酶MNase來(lái)切割并測(cè)序。該技術(shù)可以鑒定組蛋白在調(diào)控染色質(zhì)可及性中的作用。MNase既可以利用內(nèi)切酶活性切割核小體間DNA，也作為外切酶活性降解未受蛋白質(zhì)保護(hù)的切割產(chǎn)物DNA。

NOMe-seq：利用來(lái)自M.CviPI的GpC甲基轉(zhuǎn)移酶MTase，通過化學(xué)修飾而不是切割可接近的DNA來(lái)探測(cè)染色質(zhì)可接近性。由于該酶可以對(duì)不受核小體或與染色質(zhì)緊密結(jié)合的其他蛋白質(zhì)保護(hù)的GpC二核苷酸(GpC^m不出現(xiàn)在人類基因組中，因此沒有GpC^m的內(nèi)源性背景)在GC處產(chǎn)生特異甲基化。由于在整個(gè)基因組中GpC的頻率很高，因此NOMe-seq可以同時(shí)檢測(cè)DNA的可及性和甲基化狀態(tài)，且不存在富集偏差和單分子特征。

單細(xì)胞可及性方法

單細(xì)胞可及性變化的測(cè)量有望揭示基因組調(diào)控的一個(gè)核心問題：短時(shí)間波動(dòng)和染色質(zhì)可及性的發(fā)育變化是如何在整個(gè)基因組中協(xié)調(diào)的？基于ATAC-seq、DNase-seq和NOMe-seq文庫(kù)制備方案，已經(jīng)開發(fā)了多種方法來(lái)測(cè)量單細(xì)胞染色質(zhì)可及性。

組合式標(biāo)簽為成千上萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞ATAC-seq的建庫(kù)提供了一種優(yōu)秀的條形碼策略。在這種方法中，用獨(dú)特的條形碼Tn5酶對(duì)純化的細(xì)胞核進(jìn)行多次轉(zhuǎn)座反應(yīng)，然后在有限稀釋度下混合進(jìn)行多重標(biāo)簽PCR反應(yīng)。

單細(xì)胞ATAC-seq可以通過捕獲單細(xì)胞微流體裝置(Fluidigm，C1)或納米孔芯片(Takara Bio，ICELL8)來(lái)實(shí)現(xiàn)。最近，單細(xì)胞ATAC-seq也已經(jīng)在10X Genomics和Bio-Rad的基于液滴的微流體平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)。早期的報(bào)告表明，這些高通量平臺(tái)將提供與納米孔捕獲技術(shù)類似的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

染色質(zhì)可及性圖譜解讀

最近對(duì)單分子和單細(xì)胞可及性的檢測(cè)表明，對(duì)細(xì)胞群體的可及性檢測(cè)代表不同分子狀態(tài)的整體平均值(圖3)。當(dāng)觀察一個(gè)潛在的、動(dòng)態(tài)的、不同步的過程時(shí)，這種分子異質(zhì)性自然會(huì)出現(xiàn)。例如，在轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，RNA聚合酶及其他TF一起，置換TSS上游的核小體，并移動(dòng)啟動(dòng)子下游位置良好但不穩(wěn)定的核小體(圖3a )。對(duì)單分子NOMe-seq數(shù)據(jù)的足跡分析揭示了這一過程，隨著轉(zhuǎn)錄過程的展開，捕捉每個(gè)分子狀態(tài)(圖3b)。盡管會(huì)受采樣效率的影響，但是單細(xì)胞可及性檢測(cè)與對(duì)整個(gè)基因組調(diào)節(jié)區(qū)域的預(yù)測(cè)得到相似的分子異質(zhì)性結(jié)果(圖3c)。

圖3、染色質(zhì)可及性的群體尺度測(cè)量反映了單分子異質(zhì)集合的平均可及性。a）轉(zhuǎn)錄活性啟動(dòng)子和基因主體的可及性表明異質(zhì)分子構(gòu)型的集合決定了群體染色質(zhì)可及性分布。b）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSSs)可及性的單分子測(cè)量反映了結(jié)合蛋白對(duì)DNA的不同保護(hù)作用。c）單細(xì)胞ATAC-seq測(cè)量持家基因位點(diǎn)的可及性，顯示DNA對(duì)轉(zhuǎn)座酶切的異質(zhì)敏感性。

染色質(zhì)可及性最近被用來(lái)鑒定全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)產(chǎn)生的因果遺傳變異。人類基因組中的大多數(shù)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)出現(xiàn)在非編碼和基因間的基因組區(qū)域，并對(duì)復(fù)雜性狀單獨(dú)產(chǎn)生小的或間接的影響，從而影響因果變異檢測(cè)。最近，一些研究利用染色質(zhì)可及性來(lái)更好地理解這些非編碼SNPs及其對(duì)性狀的影響。例如，Maurano等人研究表明，許多因果GWAS變異集中在非編碼DHSs（DNase hypersensitivity sites）中，并且可以通過使用染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確地與它們影響的基因聯(lián)系起來(lái)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了將染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)與功能和其他表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)分析相結(jié)合的價(jià)值。

可及性的生物物理決定因素

在真核生物基因組中，對(duì)染色質(zhì)化DNA的物理接觸受到不同長(zhǎng)度尺度的調(diào)控，并且很大程度上取決于核小體和DNA相關(guān)大分子的組織和占據(jù)，包括TFs和結(jié)構(gòu)蛋白。DNA幾乎普遍被組蛋白或其他DNA結(jié)合因子結(jié)合，盡管這些因子在TF長(zhǎng)度尺度上局部阻斷DNA結(jié)合，但非抑制因子對(duì)DNA的競(jìng)爭(zhēng)往往會(huì)增加核小體長(zhǎng)度尺度上的可及性。TF結(jié)合與可及性相關(guān)的原因可能是多種原因造成的。首先，包括TFs和聚合酶等DNA結(jié)合蛋白的足跡通常遠(yuǎn)小于核小體占據(jù)的約146 bp。因此，與完整核小體相比，非組蛋白結(jié)合使DNA更容易接近。第二，分子間的相互作用基本上是隨機(jī)的，非組蛋白與DNA復(fù)合物的平均停留時(shí)間通常比核小體周轉(zhuǎn)的時(shí)間更短，因此可以更頻繁地接觸未結(jié)合的DNA。最后，序列依賴性結(jié)合蛋白與DNA的非特異性染色質(zhì)重塑提供了一種補(bǔ)充底物，這種重塑通常通過去除或重新定位核小體來(lái)進(jìn)一步打開近端染色質(zhì)?？紤]到這些因素，組蛋白的線性和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在啟動(dòng)DNA獲取方面都有著巨大的作用。

圖4、核小體周轉(zhuǎn)率和占據(jù)率在大尺度基因組區(qū)域內(nèi)呈反比關(guān)系。易接近的染色質(zhì)在高核小體周轉(zhuǎn)率的基因組區(qū)域內(nèi)富集，也與密集核小體占據(jù)一致。

染色質(zhì)可及性重塑

對(duì)染色質(zhì)化DNA的物理接觸是隨著外部刺激和發(fā)育階段而動(dòng)態(tài)變化的。染色質(zhì)的可及性在整個(gè)基因組中受到多種因素調(diào)控。TFs在這一過程中必然起著中心組織作用，因?yàn)橹厮軝C(jī)制的其他組成部分很大程度上不提供DNA序列特異性。然而，絕大多數(shù)被檢測(cè)的TFs只與可接近的核小體耗盡的DNA結(jié)合；這種生物物理限制的典型例子是熱休克因子，在核心組蛋白存在的情況下，熱休克因子不能結(jié)合到它的同源DNA靶上，而是依賴于熱休克啟動(dòng)子無(wú)處不在的可及性來(lái)快速誘導(dǎo)反應(yīng)基因。因此，TFs如何與封閉染色質(zhì)相互作用以提供序列特異性可及性重塑的機(jī)制問題仍然是一個(gè)深入研究的課題。這里研究者提出幾個(gè)工作模型解釋了TFs和活躍核小體重塑子的協(xié)同作用是如何建立和維持可及性狀態(tài)的(圖5)。

圖5、染色質(zhì)可及性重塑模型。a）轉(zhuǎn)錄因子(TFs)通過與動(dòng)態(tài)核小體(以淺灰色顯示)的被動(dòng)競(jìng)爭(zhēng)引發(fā)可及性重塑。核小體的周轉(zhuǎn)動(dòng)力學(xué)受局部DNA序列、組蛋白組成和特定染色質(zhì)重塑子(CR)活性的調(diào)節(jié)。TF結(jié)合位點(diǎn)的被動(dòng)競(jìng)爭(zhēng)可能涉及核小體滑動(dòng)或驅(qū)逐。b）與活性染色質(zhì)重塑子一起，TFs置換瞬時(shí)結(jié)合到非核小體模板上的結(jié)構(gòu)蛋白(APs)，以啟動(dòng)順式核小體驅(qū)逐?；钚院诵◇w位移通過與新獲得的DNA結(jié)合的次級(jí)轉(zhuǎn)移因子來(lái)穩(wěn)定。c）激活的TF與組成性可獲得的增強(qiáng)子結(jié)合，并通過招募活躍的染色質(zhì)重塑子和穩(wěn)定次級(jí)TFs (SFs)來(lái)介導(dǎo)核小體驅(qū)逐和可及性重塑。d）先鋒轉(zhuǎn)錄因子與核小體DNA結(jié)合，并獨(dú)立或與活躍的染色質(zhì)重塑子一起直接打開染色質(zhì)。核小體驅(qū)逐后次級(jí)TFs的結(jié)合穩(wěn)定了新建立的可及性狀態(tài)。

結(jié)論和未來(lái)發(fā)展方向

染色質(zhì)可及性是通過組蛋白、TFs和活性染色質(zhì)重塑者之間的動(dòng)態(tài)相互作用建立的。核小體的占有和定位是可及性的主要決定因素，并受到序列特異性TFs和染色質(zhì)重塑子的調(diào)控。這種相互作用是通過亞組蛋白規(guī)模的TFs對(duì)核小體DNA的直接競(jìng)爭(zhēng)或者通過招募活躍的染色質(zhì)重塑子來(lái)動(dòng)態(tài)驅(qū)逐核小體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。核小體不僅僅是一個(gè)壓抑的單位，而是染色質(zhì)調(diào)控景觀的中心組成部分。未來(lái)幾年，新的單分子和單細(xì)胞方法將會(huì)揭示這一模式的生物物理和功能含義。

染色質(zhì)狀態(tài)和功能之間存在著復(fù)雜的相互作用，一個(gè)例子涉及增強(qiáng)子和啟動(dòng)子可及性的轉(zhuǎn)錄影響；盡管兩者對(duì)于轉(zhuǎn)錄都是必需的，并與活性相關(guān)，但轉(zhuǎn)錄沉默基因的非活性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子通常是開放的，這表明染色質(zhì)可及性對(duì)于增強(qiáng)子或啟動(dòng)子活性是必需單不充分的。這些穩(wěn)定的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子是可接近的，但缺乏活性調(diào)節(jié)區(qū)的明確標(biāo)記，包括增強(qiáng)子RNA (eRNA )生成和組蛋白乙酰化。另一個(gè)可及性和轉(zhuǎn)錄活性不一致的例子是在發(fā)育中的黑腹果蠅的合子基因激活期間：盡管激活前在早期胚胎中觀察到染色質(zhì)的廣泛開放，但是許多可及性基因在轉(zhuǎn)錄上是不活躍的，直到發(fā)育后期。

直到最近，由于大量的材料需求，臨床樣本在很大程度上難以進(jìn)行表觀遺傳學(xué)分析。然而，小規(guī)模染色質(zhì)可及性分析的進(jìn)展預(yù)示著廣泛的臨床影響，特別是對(duì)于理解復(fù)雜的疾病狀態(tài)，如造血致癌和免疫衰竭。最近對(duì)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的研究揭示了癌基因失調(diào)的易接近性特征和治療干預(yù)的表觀遺傳學(xué)含義。整合單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄測(cè)量，包括最近關(guān)于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)可及性測(cè)量的報(bào)告，將進(jìn)一步拓寬人們對(duì)疾病表觀遺傳學(xué)基礎(chǔ)的理解和表觀基因組學(xué)的臨床應(yīng)用空間。

染色質(zhì)可及性代表了表觀基因組的功能，定義了整個(gè)基因組中一系列假定的調(diào)控區(qū)域。增強(qiáng)子、絕緣體、啟動(dòng)子和基因體之間開放染色質(zhì)的組織提供了一個(gè)可延展的生物物理模板，染色質(zhì)表觀基因組的成分通過該模板相互作用。了解這些調(diào)控域是如何隨著細(xì)胞在發(fā)育階段和細(xì)胞激活狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變而動(dòng)態(tài)建立的，以及調(diào)控元件如何塑造基因表達(dá)程序的生物物理規(guī)則，將是未來(lái)幾年表觀遺傳學(xué)研究的一個(gè)重要焦點(diǎn)。

原文網(wǎng)址：https://www.nature.com/articles/s41576-018-0089-8

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