Science of the Total Environment：利用高通量絕對(duì)豐度定量方法解析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化

發(fā)稿時(shí)間：2018-12-28來源：天昊生物

英文題目: Use of an improved high-throughput absolute abundance quantification

method to characterize soil bacterial community and dynamics

中文題目：利用改進(jìn)的高通量絕對(duì)豐度定量方法解析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化

期刊名：Science of the Total Environment

發(fā)表時(shí)間：2018年

影響因子：4.65

研究背景:

一個(gè)群落，如生態(tài)學(xué)所定義的，主要由三個(gè)基本屬性：絕對(duì)豐度，相對(duì)豐度和物種類型。物種的相對(duì)豐度可由絕對(duì)豐度來計(jì)算，但絕對(duì)豐度不可以通過相對(duì)豐度計(jì)算出來。在定量生態(tài)學(xué)中，絕對(duì)豐度為一個(gè)物種提供了準(zhǔn)確的信息，而相對(duì)豐度則可用來描述一個(gè)群落中的不同物種組成。

目前的高通量測序技術(shù)，可以在一個(gè)群落中檢測到數(shù)以千計(jì)的OTUs，這極大地?cái)U(kuò)展了我們對(duì)其物種類型和相對(duì)豐富度的深刻理解。雖然相對(duì)豐度可以描述微生物群落中的優(yōu)勢物種，但是當(dāng)進(jìn)行多個(gè)群落物種比較時(shí)，相對(duì)豐度就不如絕對(duì)豐度更有效。近年來，高通量測序與微生物定量技術(shù)相結(jié)合，如流式細(xì)胞（FCM）、定量PCR（qPCR）、磷脂脂肪酸（PLFAs），用以獲得空氣、水和土壤中微生物的絕對(duì)豐度，這些研究都發(fā)現(xiàn)微生物相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度得到的結(jié)果趨勢不一致。

值得注意的是微生物總數(shù)的精確定量是獲得可靠微生物絕對(duì)豐度的關(guān)鍵。但是用幾種方法測量同一樣品是耗時(shí)的，而不同方法的組合又可能增加結(jié)果的不確定性，例如，用FCM方法檢測的北京土壤樣品中細(xì)菌總生物量的平均值高于西藏土壤樣品，而用MBC方法測得的北京和西藏土壤樣品中細(xì)菌總生物量的平均值則相反，顯然，基于FCM和MBC計(jì)算的土壤細(xì)菌絕對(duì)豐度是不一致的。因此，提出一個(gè)既能減少操作過程或不確定性，又能高通量可靠地獲得微生物絕對(duì)豐度的簡單方法就顯得尤為重要。

研究目的:

1） 提出了一種通過添加內(nèi)標(biāo)菌株(ISS) HAAQ-GFP來準(zhǔn)確解析土壤細(xì)菌群落及其動(dòng)態(tài)變化的高通量絕對(duì)豐度定量方法（HAAQ）。

2） 確定該方法的最佳實(shí)驗(yàn)條件。

3） 研究不同階段(土壤及其母質(zhì))和疊氮化鈉處理土壤中的細(xì)菌種群分布及其動(dòng)態(tài)變化。

HAAQ方法描述：

1） 采用顯微鏡計(jì)數(shù)法對(duì)內(nèi)標(biāo)菌株(ISS) HAAQ-GFP進(jìn)行絕對(duì)定量。

2） 向土壤中加入一定量的內(nèi)標(biāo)菌株(ISS) HAAQ-GFP懸浮液，并在提取土壤DNA之前與土壤顆粒充分?jǐn)嚢?。提取土?span>DNA后，對(duì)DNA樣品進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增子測序從而得到相對(duì)豐度。

3） 利用內(nèi)標(biāo)菌株(ISS) HAAQ-GFP的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度，首先計(jì)算土壤原生細(xì)菌的總絕對(duì)豐度。然后，通過總絕對(duì)豐度乘以相應(yīng)的相對(duì)豐度，得到每個(gè)分類單元的絕對(duì)豐度。通過各分類單元水平的絕對(duì)豐度和其他衍生指數(shù)揭示了土壤細(xì)菌生態(tài)的數(shù)量。

圖1  HAAQ方法的工作流程

土壤樣本和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

實(shí)驗(yàn)土壤樣品是從菜地表層(A horizon)和福建和浙江的部分風(fēng)化層(C horizon)采集。利用帶冰袋的冷卻器將每個(gè)取樣點(diǎn)的三個(gè)土壤樣品帶到實(shí)驗(yàn)室。土壤母質(zhì)（紫砂巖）分別從C horizon的三份樣品中選擇，并在過篩前用液氮粉碎。去除植物殘?jiān)褪瘔K后，將散裝新鮮土壤用2mm塑料網(wǎng)過篩，將其徹底均勻化，然后儲(chǔ)存在4°C。為確定ISS HAAQ-GFP在土壤樣品中的最佳添加濃度，在福建省采集的10g凍干土中添加0.4mL濃度梯度為3.10×10¹¹-3.10×10⁶細(xì)胞/mL的ISS HAAQ-GFP。將ISS HAAQ-GFP的細(xì)菌懸液均勻地噴灑在土壤樣品表面，然后與無菌玻璃棒充分混合5分鐘。特別建立一系列6個(gè)ISS HAAQ-GFP細(xì)胞濃度的土壤處理樣品，分別為10¹⁰-10⁵細(xì)胞/g，稱為處理T10-T5，同時(shí)向土壤中添加相同體積的無菌水作為對(duì)照。

統(tǒng)計(jì)分析：

利用大腸桿菌屬Escherichia的相對(duì)豐度和ISS HAAQ-GFP的絕對(duì)豐度，使用以下方程計(jì)算土壤總原生細(xì)菌的絕對(duì)豐度：其中Ii是各接種處理中ISS HAAQ-GFP的絕對(duì)豐度，Ri和Rc分別是各接種處理和對(duì)照中相關(guān)大腸桿菌屬Escherichia的相對(duì)豐度，Z和T分別是原生大腸桿菌屬Escherichia和土壤總原生細(xì)菌的絕對(duì)豐度。

與處理T10-T5相對(duì)應(yīng)，計(jì)算公式Eq. (1)土壤原生細(xì)菌總數(shù)（T）有6個(gè)絕對(duì)豐度，然后用相對(duì)豐度乘以每個(gè)處理(T10-T5)土壤原生細(xì)菌總數(shù)(T)+ISS HAAQ-GFP(Ii)絕對(duì)豐度總和來計(jì)算每個(gè)屬的絕對(duì)豐度，從Eq. (1)得到的T10-T5在屬水平上的絕對(duì)豐度數(shù)據(jù)集稱為E10-E5。根據(jù)對(duì)照組每個(gè)屬的相對(duì)豐度乘以T10-T5土壤原生細(xì)菌總數(shù)(T)，得到屬水平上絕對(duì)豐度的額外數(shù)據(jù)集(E10c-E5c)。

   我們檢測了和內(nèi)標(biāo)菌ISS HAAQ-GFP歸屬于同一屬的土壤原生相關(guān)大腸桿菌屬Escherichia是否會(huì)影響數(shù)據(jù)分析，因此在另個(gè)一個(gè)計(jì)算公式Eq. (E1)中將土壤原生相關(guān)大腸桿菌屬視為零。

研究結(jié)果：

內(nèi)標(biāo)菌株(ISS) HAAQ-GFP絕對(duì)定量

對(duì)10幅圖像進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖2A），ISS HAAQ-GFP平均濃度約為3.09×10⁷細(xì)胞/mL。用平板計(jì)數(shù)法和顯微鏡計(jì)數(shù)法測得的2倍梯度稀釋的ISS HAAQ-GFP濃度之間存在相關(guān)性（圖2B）。T10-T5處理土壤中添加的ISS HAAQ-GFP含量范圍為1.23×10¹⁰-1.23×10⁵ 細(xì)胞/g干土。

圖2 本研究中ISS HAAQ-GFP的測定。A、激光掃描共聚焦顯微鏡下細(xì)菌懸液中ISS HAAQ-GFP的一幅熒光圖像。B、在2倍梯度稀釋液中通過平板計(jì)數(shù)（Y軸，CFU /mL）獲得的ISS HAAQ-GFP濃度與顯微鏡計(jì)數(shù)方法（X軸，細(xì)胞/mL）的相關(guān)性。

土壤細(xì)菌群落的相對(duì)豐度

經(jīng)過質(zhì)量過濾，獲得29953個(gè)OTU（852,842 reads），通過RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類，對(duì)照土壤中以Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Firmicutes為主，占土壤原生細(xì)菌總數(shù)的67.21±2.33％。

ISS HAAQ-GFP在RDP數(shù)據(jù)庫中被歸為大腸桿菌/志賀菌屬Escherichia/Shigella，在Greengenes數(shù)據(jù)庫中被歸為腸桿菌科的一個(gè)未命名屬。在處理T5-T10中，隨著ISS HAAQ-GFP的添加，log 10轉(zhuǎn)化得到的Escherichia相對(duì)豐度呈線性增加（圖2C）。對(duì)于每個(gè)處理，基于RDP數(shù)據(jù)庫和Greengenes數(shù)據(jù)庫得到的大腸桿菌相對(duì)豐度沒有顯著差異。而16S rRNA拷貝數(shù)經(jīng)過校正（RDP adj）后（校正原因：細(xì)菌基因組中16S rRNA基因的拷貝數(shù)從1到15不等，這將偏離細(xì)菌的真實(shí)組成，據(jù)報(bào)道，ISS HAAQ-GFP的16S rRNA基因有7個(gè)拷貝數(shù)，在RDP和Greengenes數(shù)據(jù)庫中未調(diào)整16S rRNA基因拷貝數(shù)的情況下，高估了ISS HAAQ-GFP的相對(duì)豐度，低估了總細(xì)菌的絕對(duì)豐度），土壤細(xì)菌群落的相對(duì)豐度完全改變，例如T9中Proteobacteria的相對(duì)豐度從72.01±2.47％（RDP）下降到43.36±3.62％（RDP adj）。

圖2 本研究中ISS HAAQ-GFP的測定。C、添加的ISS HAAQ-GFP與處理T10-T5中基于RDP、RDPadj和Greengenes數(shù)據(jù)庫得到的大腸桿菌屬相對(duì)豐度的關(guān)系。

土壤細(xì)菌群落的絕對(duì)豐度

除T10處理外，T9～T5處理間土壤原生細(xì)菌絕對(duì)豐度無顯著差異（表1）。此外，將基于Eq.1 和 Eq.(E1)（詳見統(tǒng)計(jì)分析）的計(jì)算結(jié)果進(jìn)行比較，大多數(shù)屬的絕對(duì)豐度沒有顯著差異，只有內(nèi)標(biāo)菌Escherichia在E10-E5和E10₀-E5₀兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間有顯著差異，說明對(duì)未受大腸桿菌污染的土壤樣品，不需要對(duì)照處理，并且本研究中細(xì)菌群落的絕對(duì)豐度僅基于Eq.1。

不同分類水平上的絕對(duì)豐度如圖3所示，RDP 和Greengenes數(shù)據(jù)庫所測得的門水平，Proteobacteria絕對(duì)豐度最高（約為1.00×10⁸細(xì)胞/g干土），其次為Acidobacteria, Actinobacteria, Firmicutes。而RDP adj數(shù)據(jù)庫顯示細(xì)菌的絕對(duì)豐度均超過1.0×10⁸細(xì)胞/g干土。在屬水平上，大多數(shù)屬的絕對(duì)豐度在10^3.5-10^6.5細(xì)胞/g干土范圍內(nèi)（圖3），在供試土壤中還觀察到一些絕對(duì)豐度超過10⁷細(xì)胞/g干土的屬，但絕對(duì)豐度在10³細(xì)胞/g干土以下的屬較少。

表1 使用HAAQ法基于RDP數(shù)據(jù)庫（HAAQ-RDP），RDP數(shù)據(jù)庫通過16S rRNA基因拷貝數(shù)校正后（HAAQ-RDP adj）和Greengenes數(shù)據(jù)庫（HAAQ-Greengenes）測定的原生細(xì)菌總絕對(duì)豐度（細(xì)胞/g干土）

土壤細(xì)菌群落的頻率分布

利用E10-E5和E10c-E5c兩個(gè)數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步分析了在屬水平上細(xì)菌絕對(duì)豐度的頻率分布（log 10轉(zhuǎn)換）（圖3）。除了T10和T9外，大多數(shù)屬濃度為10^3.5-10 ^6.5細(xì)胞/g干土。

隨著ISS HAAQ-GFP在T10-T5中的濃度降低，E10-E5與E10c-E5c數(shù)據(jù)集的重疊程度增加，同時(shí)頻率分布符合部分對(duì)數(shù)正態(tài)分布（圖3）。 處理T10-T5，擬合曲線的形狀逐漸變寬（圖3）。利用擬合的部分對(duì)數(shù)正態(tài)分布方程，可以預(yù)測E10-E5數(shù)據(jù)集頻率分布中的缺失部分，即E10-E5數(shù)據(jù)集中低豐度未檢出屬的預(yù)測頻率（圖3中的黑色柱子）。

圖3 屬水平上細(xì)菌絕對(duì)豐度的頻率計(jì)數(shù)（對(duì)數(shù)10（細(xì)胞/g干土）。E10-E5和E10c-E5c兩個(gè)數(shù)據(jù)集分別代表了處理組T10-T5和對(duì)照組基于Eq. (1)計(jì)算的每個(gè)屬的絕對(duì)豐度。這些曲線是從E10-E5（紅色）和E10c-E5c（灰色）兩個(gè)數(shù)據(jù)集的部分對(duì)數(shù)正態(tài)分布擬合得到的。黑色柱子是E10-E5數(shù)據(jù)集中低豐度未檢出屬的預(yù)測頻率。

ISS HAAQ-GFP對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

主成分分析（PCA）表明，隨著ISS HAAQ-GFP添加量的增加，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更加變化（圖4）。PCA分析表明，E10和E9數(shù)據(jù)與Ec數(shù)據(jù)組相距較遠(yuǎn)，說明與對(duì)照相比，T10和T9處理的細(xì)菌數(shù)量發(fā)生了很大的變化。然而T8和T5處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與對(duì)照靠的很近（圖4）。

此外，物種豐富度指數(shù)隨著添加ISS HAAQ-GFP而發(fā)生改變。分別用RDP、RDP.或Greengenes數(shù)據(jù)庫分析時(shí)，對(duì)照的物種豐富度指標(biāo)（Genus number,Simpson，Shannon）各不相同。T10各物種豐富度指數(shù)均顯著低于對(duì)照，但處理T9-T5與對(duì)照間差異不顯著。

圖4 在屬水平上對(duì)由絕對(duì)豐度組成的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析

HAAQ方法的應(yīng)用

根據(jù)圖3,4的結(jié)果，當(dāng)ISS HAAQ-GFP加入濃度在10⁵-10⁷細(xì)胞/g干土范圍內(nèi)時(shí)，土壤細(xì)菌數(shù)量生態(tài)學(xué)的變化可以忽略不計(jì)。然后使ISS HAAQ-GFP加入濃度為10⁶細(xì)胞/g干土?xí)r，進(jìn)行了兩次應(yīng)用。應(yīng)用I的結(jié)果表明， 在土壤發(fā)育過程中，土壤原生細(xì)菌的總絕對(duì)豐度由3.55 × 10 ⁸ ± 5.93 × 10 ⁷細(xì)胞/g（土壤母質(zhì)）增加到1.70 × 10 ⁹ ± 2.13 × 10 ⁸細(xì)胞/g（土壤）（圖5A）?？偨^對(duì)豐度增加后，部分對(duì)數(shù)正態(tài)分布擬合曲線逐漸變寬（圖5B）。25個(gè)門中，20個(gè)門的絕對(duì)豐度顯著增加，而只有12個(gè)門的相對(duì)豐度顯著增加（圖5A），例如，Acidobacteria和Chloroflexi的相對(duì)豐度沒有顯著變化，但是它們的絕對(duì)豐度顯著增加（圖5A）。此外，Actinobacteria和Latescibacteria相對(duì)豐度顯著降低，但絕對(duì)豐度顯著增加（圖5A）。此外，在屬水平上相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度也有不同的變化趨勢（圖5C和D）。33.87%菌屬的絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度呈現(xiàn)相反趨勢（圖5C中的part I）。在土壤發(fā)育過程中，49個(gè)屬的相對(duì)豐度顯著降低，而71個(gè)屬（49屬中的25屬和額外的46屬）的絕對(duì)豐度顯著增加（圖5C）。在土壤發(fā)育過程中，相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度均降低的屬約占總屬7.80％（圖5C中的parts II）；相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度均增加的屬約占總屬的58.33％（圖5C中的parts III）。這三種趨勢的代表屬如圖5D所示。

圖5 用HAAQ法對(duì)土壤及其母質(zhì)進(jìn)行細(xì)菌生態(tài)定量分析。A、門水平細(xì)菌的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度。B、屬水平細(xì)菌絕對(duì)豐度的頻率計(jì)數(shù)。C、屬水平上相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度比較的餅圖和維恩圖。在餅圖中，part I，相對(duì)豐度下降，但絕對(duì)豐度增加；part II or III，相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度都減少或增加。在Venn圖中，紅色圓圈中的數(shù)字表示這些屬的相對(duì)豐度顯著變化，紫、藍(lán)、黃三色的數(shù)量代表這些屬的絕對(duì)豐度顯著變化，灰色圓圈數(shù)表示屬間相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度均無顯著差異。紅色和黑色箭頭分別表示相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的增加和減少。D、餅圖中三個(gè)部分（I、II和III）的代表屬。PM表示土壤母質(zhì)。

對(duì)于應(yīng)用II，在疊氮化鈉處理土壤中,土壤原生細(xì)菌的總絕對(duì)豐度由3.85 × 10 ⁸ ± 5.26 × 10 ⁷細(xì)胞/g (S0，疊氮化鈉處理后培養(yǎng)0天)減少到9.56 × 10⁷ ± 5.36 × 10 ⁷細(xì)胞/g (S14，疊氮化鈉處理后培養(yǎng)14天) （圖6A）。細(xì)菌總絕對(duì)豐度降低后，部分對(duì)數(shù)正態(tài)分布擬合曲線變窄（圖6B）。在17個(gè)門中，9個(gè)門的相對(duì)豐度顯著降低（圖6A），然而，有15個(gè)門的絕對(duì)豐度顯著降低（圖6A）。例如，Acidobacteria 和Candidatus Saccharibacteria的相對(duì)豐度沒有顯著變化，但絕對(duì)豐度顯著降低（圖6A）。此外，在屬水平上相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度呈現(xiàn)不同趨勢（圖6C和D）。大約有40.58%的屬在培養(yǎng)14天后絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度呈現(xiàn)相反趨勢（圖6C中的part I）。在疊氮化鈉的抑菌作用下，14個(gè)屬的絕對(duì)豐度顯著降低，14個(gè)屬中有8個(gè)屬的相對(duì)豐度顯著增加（圖6C）。此外，圖6C中的8個(gè)屬的相對(duì)和絕對(duì)豐度均有所增加，但其絕對(duì)豐度增加不顯著。

圖6 采用HAAQ法對(duì)疊氮化鈉處理土壤的細(xì)菌生態(tài)進(jìn)行了定量研究。A、在門水平上細(xì)菌的相對(duì)和絕對(duì)豐度。B、屬水平上細(xì)菌絕對(duì)豐度的頻率計(jì)數(shù)。C、屬水平上相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度比較的餅圖和維恩圖。在餅圖中，part I，相對(duì)豐度增加，但絕對(duì)豐度減少；part II or III，相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度分別減少或增加。在Venn圖中，紅色圓圈中的數(shù)字表示這些屬的相對(duì)豐度顯著變化，紫、藍(lán)、黃三色的數(shù)量代表這些屬的絕對(duì)豐度顯著變化，灰色圓圈數(shù)表示屬間相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度均無顯著差異。D、餅圖中三個(gè)部分（I、II和III）的代表屬。土壤樣品分別在疊氮化鈉處理后培養(yǎng)0天(S0)和14天(S14)。

如網(wǎng)絡(luò)所示，應(yīng)用I（圖7A）和應(yīng)用II（圖7B）中的兩個(gè)樣本分別共有322個(gè)屬（84.51%）和304個(gè)屬（98.38%）。圖7C和圖D分別顯示了應(yīng)用I和II的top20共有屬，應(yīng)用Ⅰ的大多數(shù)屬（58.33%）的絕對(duì)豐度增加，而應(yīng)用Ⅱ的大多數(shù)屬（56.82%）則減少。

圖7 在兩個(gè)應(yīng)用中，屬水平上的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)（A，B）和前20個(gè)共享屬（C，D）。在應(yīng)用I中，S和P分別代表土壤及其母質(zhì)。在應(yīng)用程序II中，S0和S14與圖6中的相同。

此外，每個(gè)應(yīng)用測試樣本的聚類模式分別以相對(duì)豐度或絕對(duì)豐度顯示（圖8），與相對(duì)豐度產(chǎn)生的熱圖相比，絕對(duì)豐度更清楚地揭示了各個(gè)菌門在樣品間的差異。

圖8 細(xì)菌群落在兩種應(yīng)用中的熱圖分別由門水平的相對(duì)豐度（A）和絕對(duì)豐度（B）產(chǎn)生

研究概要：

高通量測序極大地?cái)U(kuò)展了我們對(duì)基于物種類型及其相對(duì)豐度信息的細(xì)菌群落的理解。近來，研究人員也意識(shí)到這種技術(shù)不考慮絕對(duì)豐度的缺陷。兩種或更多種不同的方法結(jié)合通常用于實(shí)現(xiàn)微生物群落的絕對(duì)定量。然而，將不同的方法組合起來不僅費(fèi)時(shí)，而且由于實(shí)驗(yàn)條件的變化，還涉及潛在的不確定性。為了簡化實(shí)驗(yàn)步驟，提高土壤細(xì)菌群落的高通量絕對(duì)豐度定量（HAAQ），我們提出了利用內(nèi)標(biāo)菌株（ISS）HAAQ-GFP同時(shí)獲得土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的HAAQ方法。結(jié)果表明，當(dāng)ISS HAAQ-GFP濃度為10⁵～10⁷細(xì)胞/g時(shí)最佳，同時(shí)將16S rRNA基因拷貝數(shù)調(diào)整時(shí)，HAAQ法能更好地解析土壤細(xì)菌群落及其動(dòng)態(tài)變化。基于HAAQ方法，首次發(fā)現(xiàn)供試土壤中細(xì)菌在屬水平上的絕對(duì)豐度符合部分對(duì)數(shù)正態(tài)分布函數(shù)，且大多數(shù)屬濃度在10^3.5-10^6.5細(xì)胞/g之間。我們的案例研究還表明，土壤細(xì)菌群落及其動(dòng)態(tài)的更全面的描述可以通過相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度來完成，而不是僅僅通過相對(duì)豐度。改進(jìn)的HAAQ方法可以應(yīng)用于其它微生態(tài)學(xué)研究同時(shí)促進(jìn)了細(xì)菌生態(tài)定量研究的發(fā)展。