【昊閱讀】SSR-seq：與傳統方法相比，利用下一代測序進行SSR基因分型可以獲得更高水平多態(tài)性

發(fā)稿時間：2018-12-21來源：天昊生物

就在天昊生物自主研發(fā)的基于illumina高通量測序平臺的--SSRseq^TM產品線上市近兩年，多項科研服務項目順利完成之際，德國和奧地利研究人員的類似方法報道才“姍姍來遲”，成功發(fā)表在10月25日Ecology and Evolution雜志上。這不僅從側面反映了天昊生物SSRseq^TM技術的可行性與前瞻性，也再次印證了我們敢為人先、堅持創(chuàng)新驅動發(fā)展的一貫理念。下面就讓我們來仔細看一下這篇文章的研究內容。

本研究提出了一個SSR-seq的名詞（我們的命名為SSRseq^TM），認為與傳統的僅僅依靠片段大小來進行評分和基因分型的方法相比，利用下一代測序技術進行SSR基因分型，可以獲得更高水平基因多態(tài)性結果。

摘要速覽

 簡單重復序列（SSR，或稱微衛(wèi)星、STR)是群體遺傳學中廣泛使用的一種分子標記。目前，對其基因分型的檢測仍然主要依靠片段長度進行。隨著下一代測序(NGS)的發(fā)展，研究者獲得感興趣基因座的序列信息變得更加容易，依靠測序數據進行SSR基因型檢測，避免因為片段大小近似而產生的錯誤判讀。本研究描述了一種NGS研究策略，該策略可以對感興趣的SSR位點進行定制化檢測，一次性完成對數百個個體的基因型分析，將多重PCR、條形碼和illumina測序相結合。本研究創(chuàng)建了三個不同的數據集，根據(a)重復區(qū)域的長度、(b)總片段長度和(c)序列一致性對等位基因進行解析，用來評估與傳統檢測方法的差別，計算遺傳多樣性及F_ST和R_ST值。通過下一代測序獲得的信息提供了比傳統SSR基因分型更好的分辨率，并允許更精確的進化解釋。

本研究利用三種被子植物：Donatia fascicularis (柱花草科)、Mulguraea tridens (馬鞭草科)和Oreobolus obtusangulus (莎草科)，總共對859個個體的58個SSR位點進行了基因型檢測及統計分析。

表1、研究物種列表

利用illumina MiSeq2000平臺paired-end模式測序。預定義的重復單位長度為3-6個堿基，微衛(wèi)星區(qū)域的最小長度為21 bp。在設計引物時，其中一個引物總是被選擇靠近SSR，以確保在SSR分析期間，單個read包含整個重復區(qū)域，從而確保配對reads的正確合并，目標長度可達450 bp。

圖1、實驗流程圖

(a)引物條形碼：物種A的n×96個個體在20個基因座上進行基因分型，n：條形碼引物組數；(b)多組別多重PCR；(c) SSR擴增子混合建庫

表2、每個位點片段大小的非同源相似性

備注：非同源相似性（Homoplasy）定義為包含未檢出的隱藏變異的片段大小(即長度相同但序列不同的等位基因)的數量除以片段大小的總數

序列數據顯示片段大小的非同源相似性現象非常普遍(表2)。物種之間的差異(所有基因座的平均值為44.7% - 63.5%)，以及一個物種內的基因座之間的差異從20%到100%不等，這是因為片段大小類別的數量與序列變異性與大小類別總數的比率不同。對于側翼區(qū)域，SNP變異比Indel變異更普遍，許多SSR基因座也包含突變的SSR基序(表3)。

表3、位點檢測信息

備注：SSR motif為SSR基序的序列，數字表示基序重復的次數。Variable sites包括SSR區(qū)域本身和側翼區(qū)域的序列變異加上重復基序數量的變異。N分別表示Variable sites、SNPs和indes的數量

利用SSR-seq方法，研究者還可以統計了等位基因總數和稀有等位基因數目（表4）。

表4、基于SSR長度、片段長度(Fr length)和序列一致性(Seq identity)的三個不同數據集的等位基因總數和稀有等位基因數目(在各自的數據集中僅出現一次)

表5、基于SSR長度、片段長度(Fr length)和序列一致性(Seq identity)的三個不同數據集的遺傳多樣性指數

備注：He是根據樣本量修正的基因多樣性。Ho是觀察雜合度。

通過表4和表5看出，三種數據集等位基因N_A、He和Ho不盡相同。雖然SSR長度和片段長度數據集的結果較為相似，但在所有三種物種中，序列一致性數據集的遺傳多樣性估計值普遍較高。大多數位點F_ST的結果較為相近，但是也有部分位點也存在顯著差異。而平均置換R_ST值也在不同物種間存在差異。

可以看出，序列一致性數據集在等位基因上的更高分辨率顯而易見，其本身在基因座之間也是高度可變的。也就是說，三個物種通過序列數據集計算的等位基因數量分別是從SSR長度數據集計算的等位基因數量的1.2 - 8.0倍、1.3 - 13倍和1.6 - 4.0倍。

本研究最終結論認為，與傳統的檢測方法相比，增加的序列信息有助于更好地理解SSR變異過程。本研究結果很好的證明了，與傳統的僅僅依靠片段大小來進行評分和基因分型的方法相比，利用下一代測序技術進行SSR基因分型，可以獲得更高水平基因多態(tài)性結果。SSR基因座測序是一種前瞻性方法，能夠檢測物種內和物種間的變異，適用于大規(guī)模和精細規(guī)模系統地理學研究。

關于天昊：

天昊生物長期從事基因及遺傳分析，可以提供包括SSR檢測在內的多項基因檢測服務。天昊生物自主研發(fā)的基于二代測序技術的SSR檢測新方法--SSRseq^TM，這種方法幾乎克服了現存所有電泳檢測方法的不足，尤其適合對多SSR位點、超高深度的分型，準確度高，并且分辨率達到單堿基的水平。因此適合所有二倍體人類、動植物、真核微生物，以及多倍體物種的SSR基因型分析。歡迎聯系我們具體咨詢！郵箱：[email protected] 電話：400-065-6886