又一篇文章，再次闡明微生物相對(duì)定量不可以替代絕對(duì)定量

發(fā)稿時(shí)間：2018-12-11來源：天昊生物

 

英文題目: Soil bacterial quantification approaches coupling with relative abundances reflecting the changes of taxa

中文題目：土壤絕對(duì)定量方法結(jié)合相對(duì)豐度能夠反映微生物類群的真實(shí)變化

期刊名：Scientific Reports

發(fā)表時(shí)間：2017年

研究背景: 

微生物在幾乎所有環(huán)境中的關(guān)鍵生物地球化學(xué)循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，尤其在土壤中，微生物群落具有較高的分類多樣性和代謝潛力，可以作為反映主要生態(tài)過程的重要生物學(xué)指標(biāo)。因此測定一些關(guān)鍵種群的豐度對(duì)于理解土壤中微生物群落的貢獻(xiàn)是相當(dāng)重要的。隨著諸如Illumina MiSeq/Hiseq測序等高通量分子技術(shù)的迅速發(fā)展，可以容易地獲得相對(duì)豐度。然而由于相對(duì)豐度表示為總樣本中的相對(duì)比例，因此這種估計(jì)反映種群實(shí)際豐度的可靠性是不夠的。將相對(duì)豐度與絕對(duì)細(xì)菌密度相結(jié)合來估計(jì)種群絕對(duì)豐度，是深入分析自然環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的重要前提。細(xì)菌密度是微生物學(xué)中的一項(xiàng)基本指標(biāo)，但其評(píng)價(jià)常常是單調(diào)乏味的，為了克服這一局限性，迫切需要快速、可靠的技術(shù)對(duì)各種環(huán)境中的微生物種群進(jìn)行定量，特別是在生物多樣性極高的土壤中。

隨著與培養(yǎng)無關(guān)的測量技術(shù)發(fā)展，各種方法，包括細(xì)菌的直接計(jì)數(shù)、生化測量和核酸分子方法，已經(jīng)被用來定量微生物的絕對(duì)數(shù)量。最近，一些研究已經(jīng)比較了這些微生物定量方法。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）和熒光顯微鏡（EM）是兩種強(qiáng)有力的直接計(jì)數(shù)方法，但。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）在計(jì)數(shù)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量方面比基于目視觀察的熒光顯微鏡（EM）方法更為快速和準(zhǔn)確。兩種方法均使用各種熒光染料對(duì)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行染色，如4′，6-二氨基-2-苯吲哚（DAPI）、吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI）和SYBR Green I（SYBR-I）等。三磷酸腺苷（ATP）作為所有活細(xì)胞的能量來源，幾十年來一直被認(rèn)為是數(shù)量估計(jì)的潛在指標(biāo)，ATP測定快速、穩(wěn)定、易于執(zhí)行，但用于估計(jì)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)時(shí)，應(yīng)輔以FCM或EM。此外，利用16S rRNA基因特異性引物進(jìn)行qPCR可作為快速靈敏的菌群定量方法。有研究比較了FCM、ATP、EM、qPCR等檢測技術(shù)在飲用水、廢水、活性污泥、底泥、土壤等不同環(huán)境條件下的細(xì)菌數(shù)量，幾乎所有的研究都證明FCM更適合于測定細(xì)胞數(shù)量。盡管FCM和ATP都被認(rèn)為是用于細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量定量的有力測量技術(shù)，但是這兩種方法需要一個(gè)土壤樣品的預(yù)懸浮程序，有效分離細(xì)菌細(xì)胞是評(píng)估微生物數(shù)量的關(guān)鍵。然而，對(duì)于哪種處理效果最好，目前尚無定論。

對(duì)于土壤基質(zhì)的狀態(tài)，定義為土壤有機(jī)質(zhì)活性組分總量的土壤微生物生物量可以通過提取微生物生化物質(zhì)的特定組分來定量。用氯仿熏蒸法測定微生物生物質(zhì)碳（MBC）的經(jīng)典方法是40年前發(fā)展起來的，但至今仍被廣泛應(yīng)用。此外，磷脂脂肪酸（PLFA）也可以作為細(xì)菌的生物標(biāo)志物，為土壤微生物的優(yōu)勢(shì)群落表征提供靈敏可重復(fù)測定，而同時(shí)無需培養(yǎng)微生物。PLFA分析與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比有許多優(yōu)點(diǎn)，如準(zhǔn)確度、定量、操作簡便，以及對(duì)微生物生理狀態(tài)和樣品保存時(shí)間沒有嚴(yán)格要求。然而，這些測量中存在的顯著差異，如FCM和PLFA，使得用相同的標(biāo)準(zhǔn)比較微生物數(shù)量變得困難。

隨著高通量核酸分子技術(shù)和微生物各種定量測定技術(shù)的發(fā)展，微生物群落的相對(duì)豐度和絕對(duì)微生物數(shù)量變得易于估算，Props等人結(jié)合高通量測序方法（16S rRNA基因）和FCM來定量冷卻水系統(tǒng)上的微生物類群絕對(duì)豐度，其結(jié)果表明相對(duì)豐度的增加不一定與絕對(duì)豐度的增加有關(guān)。Stammler等人表明將16S rRNA基因擴(kuò)增子測序技術(shù)和qPCR技術(shù)相結(jié)合，可以為腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)提供新的見解。Smeet等人發(fā)明了一種在DNA提取過程中加入一個(gè)內(nèi)標(biāo)的方法，通過16S rRNA基因擴(kuò)增子測序技術(shù)可同時(shí)測定土壤細(xì)菌數(shù)量和群落組成。然而，結(jié)合絕對(duì)數(shù)值和相對(duì)數(shù)值來揭示不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的差異，目前仍然缺乏系統(tǒng)的研究。此外，不同氣候的土壤有利于進(jìn)行微生物群落的比較，本研究收集了青藏高原和北京松山的不同草原土壤。利用Illumina MiSeq技術(shù)對(duì)微生物16S rRNA基因片段進(jìn)行測序，分析微生物群落的相對(duì)豐度。應(yīng)用ATP、FCM、qPCR、PLFA和MBC等多種測量手段對(duì)所有微生物體的總數(shù)進(jìn)行量化和系統(tǒng)比較。我們的結(jié)果表明，在微生物群落研究中，微生物物種的相對(duì)豐度不足以準(zhǔn)確反應(yīng)物種的絕對(duì)豐度，因此細(xì)菌絕對(duì)豐度的定量分析對(duì)于微生物群落的綜合分析是必不可少的。

研究對(duì)象：

采集了位于青藏高原和北京松山的草原土壤，每個(gè)地點(diǎn)采集10個(gè)土壤樣本。

研究結(jié)果：

北京和西藏草原土壤中物種的相對(duì)豐度分析

從這兩個(gè)采樣點(diǎn)的20個(gè)樣本中總共獲得了1118928個(gè)序列，每個(gè)樣本獲得24931-83244個(gè)序列，DCA分析表明，兩個(gè)采樣點(diǎn)的微生物群落結(jié)構(gòu)顯著不同，這已由三種非參數(shù)多變量置換分析方法(MRPP、ANOSIM和ADOIS)證實(shí)。在門水平上進(jìn)一步比較微生物分類學(xué)組成表明，46個(gè)門中的24個(gè)被所有樣本共享，其中9個(gè)門占每個(gè)樣本序列的90%以上，北京和西藏草地細(xì)菌門類中以變形菌門和放線菌門最多（圖1），其余7個(gè)門在兩處均占優(yōu)勢(shì)，包括Acidobacteria, Bacteroidetes,Verrucomicrobia, Planctomycetes, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Cyanobacteria。

 

圖1 兩個(gè)采樣點(diǎn)9個(gè)優(yōu)勢(shì)門的相對(duì)豐度

以95%置信區(qū)間(CI)對(duì)兩個(gè)采樣點(diǎn)之間主要門類的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度進(jìn)行了響應(yīng)率分析(圖2a)，在主要門的相對(duì)豐度上，北京地區(qū)的Proteobacteria變性菌門顯著高于西藏，而Verrucomicrobia疣微菌門、Planctomycetes浮霉菌門和Cyanobacteria藍(lán)細(xì)菌門顯著低于西藏（圖2a）。

 

圖2 北京和西藏草原主要門類相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度(EAA)差異的響應(yīng)比。在95%的置信水平下，使用響應(yīng)比分析確定顯著性。響應(yīng)變量的95%CI不與0重疊表示顯著結(jié)果，否則不顯著。響應(yīng)比大于零表示北京樣品的豐度大于西藏樣品，反之亦然。

多種方法的微生物絕對(duì)定量結(jié)果比較

因?yàn)椴煌⑸锝^對(duì)定量方法得到的樣品中微生物定量結(jié)果含有不同的單位，從而造成無法進(jìn)行比較，通過換算，最終將所有微生物定量方法的定量結(jié)果全部換算為每克干土中所含細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)或者16S拷貝數(shù)(表1)。ATP、FCM、qPCR和PLFA等定量方法的所有測試都顯示出良好的重復(fù)性，但MBC方法則與其他方法明顯不一致(圖3)。

 

表1 不同絕對(duì)定量方法測定的土壤樣品中的微生物生物量

 

圖3不同測量方法得到的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的比較

不同地點(diǎn)的微生物數(shù)量比較

不同的微生物定量方法表明兩個(gè)采樣點(diǎn)之間的微生物數(shù)量顯著不同(表1，圖4)。通過ATP方法發(fā)現(xiàn)，北京采樣點(diǎn)的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)顯著高于西藏，這與FCM、qPCR和PLFA結(jié)果相似。而MBC方法發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)明顯低于西藏地區(qū)，這與其他方法不一致。此外，Pearson相關(guān)分析表明，除MBC外，其它指標(biāo)均與環(huán)境因子（土壤水分和TOC）顯著相關(guān)，因此，MBC測量結(jié)果被排除在后續(xù)分析之外。

 

圖4 比較兩個(gè)采樣點(diǎn)之間的總細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001）。

北京和西藏采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)物種的估算絕對(duì)豐度(EAA)

我們將四種不同方法（ATP、FCM、qPCR和PLFA）測定的總細(xì)菌數(shù)量與優(yōu)勢(shì)門的相對(duì)豐度（16SrRNA擴(kuò)增子測序）相結(jié)合。由于北京樣品的總微生物絕對(duì)細(xì)胞數(shù)明顯高于西藏，因此主要門的估計(jì)絕對(duì)豐度(EAA)（EAA定義為某微生物類群的相對(duì)豐度乘以總的絕對(duì)微生物細(xì)胞數(shù)）與利用ATP測定的相應(yīng)相對(duì)豐度呈現(xiàn)出明顯不同的變化趨勢(shì) (圖1和圖5)。對(duì)于變形菌門Proteobacteria，北京地區(qū)樣本的相對(duì)豐度和估計(jì)絕對(duì)豐度EAA均顯著高于西藏地區(qū)。

 

 

圖1 兩個(gè)采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)門的相對(duì)豐度

 

圖5 兩個(gè)采樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)門的估計(jì)絕對(duì)豐度(EAA)

然而，一些優(yōu)勢(shì)門的估計(jì)絕對(duì)豐度EAA與對(duì)應(yīng)的相對(duì)豐度相比發(fā)生了顯著變化，例如北京地區(qū)樣本中Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi 和 Gemmatimonates的相對(duì)豐度與西藏樣品無顯著差異，但北京地區(qū)樣本這些物種的估計(jì)絕對(duì)豐度EAA則顯著高于西藏樣品（圖2）。此外，北京地區(qū)Verrucomicrobia和Planctomycetes的相對(duì)豐度顯著高于西藏，但是其估計(jì)絕對(duì)豐度EAA則無明顯差異（圖2）。

 

圖2 北京和西藏草原主要門類相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度(EAA)差異的響應(yīng)比。在95%的置信水平下，使用響應(yīng)比分析確定顯著性。響應(yīng)變量的95%CI不與0重疊表示顯著結(jié)果，否則不顯著。響應(yīng)比大于零表示北京樣品的豐度大于西藏樣品，反之亦然。

估計(jì)絕對(duì)豐度(EAA)與相對(duì)豐度和定量檢測之間關(guān)系的概念模型

與宏觀生態(tài)學(xué)一樣，相對(duì)豐度的差異也不適合解釋自然條件下微生物群落的真實(shí)豐度差異。在本研究中，我們將利用高通量測序方法得到的相對(duì)豐度與各種定量方法得到的絕對(duì)微生物量相結(jié)合，研究了土壤微生物群落的組成。根據(jù)我們的結(jié)果，我們提出了將相對(duì)豐度與定量結(jié)果相結(jié)合得到一個(gè)估算絕對(duì)豐度EAA的概念模型（圖6）。如圖6所示，在給定的群落1和群落2中(均有5個(gè)物種，每個(gè)物種一種顏色)，群落1有N個(gè)個(gè)體，群落2有M個(gè)個(gè)體，其中N大約是M的一半，計(jì)算每種顏色物種的相對(duì)豐度，同時(shí)將定量檢測與相對(duì)豐度相結(jié)合可得到估算絕對(duì)豐度EAA。當(dāng)僅基于相對(duì)豐度時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)群落1中紅色物種的相對(duì)豐度高于群落2，但把相對(duì)豐度與總微生物量結(jié)合在一起，轉(zhuǎn)化成估算絕對(duì)豐度EAA后，我們發(fā)現(xiàn)群落1中紅色物種的估算絕對(duì)豐度EAA則低于群落2。

 

圖6 估計(jì)絕對(duì)豐度(EAA)與相對(duì)豐度和定量檢測之間關(guān)系的概念模型

 

研究概要：

了解某些細(xì)菌類群的豐度變化，對(duì)土壤微生物學(xué)研究具有重要意義。然而，通過高通量技術(shù)觀察到的相對(duì)豐度的差異可能不能準(zhǔn)確地反映實(shí)際分類單元的豐度。本研究旨在探討土壤微生物相對(duì)豐度分析與微生物定量方法是否存在耦合關(guān)系，對(duì)于描述不同地區(qū)土壤微生物種群分布是否更有意義。本文采用16S rRNA高通量測序技術(shù)分析了北京和西藏草原土壤微生物群落中主要物種的相對(duì)豐度，并采用三磷酸腺苷（ATP）、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、定量實(shí)時(shí)PCR（qPCR）、磷脂脂肪酸（PLFA）和微生物量碳（MBC）等多個(gè)與培養(yǎng)無關(guān)的技術(shù)直接或間接地定量細(xì)菌的絕對(duì)細(xì)胞數(shù)，通過對(duì)土壤微生物群落中主要組分的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度(EAA)的比較,發(fā)現(xiàn)Actinobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Chloroflexi,Gemmatimonates， Planctomycetes等優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度(EAA) 表現(xiàn)出明顯不同的變化趨勢(shì)。這些結(jié)果表明EAA的變化在描述群落中種群的動(dòng)態(tài)方面可能更具有信息性。土壤微生物的進(jìn)一步研究應(yīng)該結(jié)合微生物群落的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)豐度來進(jìn)行不同地點(diǎn)的比較，因此細(xì)菌的絕對(duì)定量分析對(duì)于微生物群落的研究未來是非常重要的。

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