The ISME Journal：為什么微生物相對(duì)定量不能代替絕對(duì)定量

發(fā)稿時(shí)間：2018-12-04來(lái)源：天昊生物

英文題目: Absolute quantification of microbial taxon abundances

中文題目：微生物類(lèi)群豐度的絕對(duì)定量

期刊名：The ISME Journal

影響因子： 9.520

發(fā)表時(shí)間：2017年

研究背景 :

基于標(biāo)記基因(如16S rRNA基因)的高通量擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為一種公認(rèn)的微生物群落分析方法，這導(dǎo)致了該技術(shù)在縱向研究中的廣泛應(yīng)用。然而該測(cè)序技術(shù)的固有局限性只是計(jì)算微生物類(lèi)群豐度的相對(duì)值。因此，我們必須謹(jǐn)慎對(duì)待這些相對(duì)豐度作出的相應(yīng)生物學(xué)解釋，這是因?yàn)?/span>這種測(cè)序技術(shù)忽略了樣本間總微生物絕對(duì)豐度的差異。據(jù)我們所知，目前還沒(méi)有相關(guān)研究來(lái)評(píng)估微生物相對(duì)豐度對(duì)真實(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)造成的歪曲影響程度。在本研究中，我們結(jié)合使用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)量的細(xì)胞密度和16S擴(kuò)增子測(cè)序得到的微生物相對(duì)豐度對(duì)冷卻水系統(tǒng)的中央蓄水池進(jìn)行了兩次廣泛的縱向調(diào)查，我們量化了微生物類(lèi)群的絕對(duì)豐度，并評(píng)估了其是否可以獲得額外的不同見(jiàn)解。

研究對(duì)象：

對(duì)在核試驗(yàn)反應(yīng)堆上運(yùn)行的二級(jí)冷卻水回路系統(tǒng)進(jìn)行兩次40天調(diào)查（79個(gè)時(shí)間點(diǎn)），包括冷卻水系統(tǒng)沒(méi)有運(yùn)行的時(shí)間段（control），冷卻水系統(tǒng)啟動(dòng)階段（start-up），冷卻水系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)運(yùn)行階段（operation）。

研究結(jié)果：

根據(jù)樣品的總細(xì)胞密度，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)微生物類(lèi)群絕對(duì)豐度，每個(gè)微生物類(lèi)群的細(xì)胞密度范圍是0.5-1679個(gè)細(xì)胞/μl。通過(guò)執(zhí)行相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度之間的普通最小二乘回歸分析，幾個(gè)微生物類(lèi)群間的差異變得明顯，我們關(guān)注其中三個(gè)最豐富的微生物類(lèi)群，它們完全代表了群落中兩個(gè)截然不同的淡水分支（圖1）。我們發(fā)現(xiàn)OTU1(betI-A分支)和OTU2以及OTU3(bacI-A分支分類(lèi)群)之間存在顯著差異，而OTU2和OTU3之間沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果表明不同微生物類(lèi)群的相同相對(duì)豐度可能需要依賴于類(lèi)群的生物學(xué)解釋?zhuān)驗(yàn)樗鼈儾灰欢?/span>具有相同的絕對(duì)豐度。

圖1對(duì)在核試驗(yàn)反應(yīng)堆上運(yùn)行的二級(jí)冷卻水回路進(jìn)行兩次時(shí)間分離的40天調(diào)查（79個(gè)時(shí)間點(diǎn)）中3個(gè)最豐富OTUs的絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度的散點(diǎn)圖

為了進(jìn)一步驗(yàn)證相對(duì)豐度的局限性，我們仔細(xì)檢查了兩個(gè)微生物分支的時(shí)間軌跡（圖2）。在解釋相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的時(shí)間軌跡時(shí)，可能檢測(cè)到兩個(gè)主要差異，如果結(jié)論僅基于相對(duì)豐度，則可能導(dǎo)致誤解：1）：在群落成長(zhǎng)期間，比如survey 1的start-up和早期 operation階段，絕對(duì)豐度有一個(gè)明確的過(guò)渡，顯示出bacI-A分支的系統(tǒng)生長(zhǎng)和衰變。相反，相對(duì)豐度分布則很模糊，在生長(zhǎng)和衰變過(guò)程中，它們始終保持相對(duì)恒定，并且開(kāi)始和結(jié)束非常明確，沒(méi)有任何過(guò)渡。2）：在survey2的operation后半部分可以觀察到相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的另一個(gè)顯著差異，相對(duì)豐度曲線顯示從±40%增加到90%以上，潛在地暗示了betI-A分支的選擇性生長(zhǎng)，相反，如果看絕對(duì)豐度，那么這個(gè)分支就沒(méi)有明顯的活躍生長(zhǎng)，其細(xì)胞密度從未顯著超過(guò)start-up階段結(jié)束時(shí)觀察到的最大密度。這種差異的原因可能是樣本中其它微生物類(lèi)群的衰退從而導(dǎo)致其在群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度比例增長(zhǎng)，但是同時(shí)環(huán)境卻限制了它絕對(duì)豐度的真實(shí)增長(zhǎng)?？偟膩?lái)說(shuō)，用絕對(duì)豐度曲線可以更精確地描述betI-A和bacI-A分支的動(dòng)態(tài)變化。另外相對(duì)豐度比例和絕對(duì)豐度的相關(guān)性較差：只有一個(gè)OTU的相對(duì)豐度(OTU2)與總細(xì)胞密度顯著相關(guān),而整個(gè)群落組成的平均相關(guān)強(qiáng)度僅為-0.08±0.15(n=427)。

圖2對(duì)在核試驗(yàn)反應(yīng)堆上運(yùn)行的二級(jí)冷卻水回路進(jìn)行兩次時(shí)間分離的40天調(diào)查期間，2個(gè)最豐富的微生物淡水分支(bacI-A(OTU2，紅色；OTU3，橙色)和betI-A(OTU1，藍(lán)色))的時(shí)間動(dòng)態(tài)圖。top panel顯示從擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)中推斷的相對(duì)豐度（in%），bottom panel顯示絕對(duì)OTU豐度（單位為細(xì)胞/μl）, 圓形標(biāo)簽表示微生物群落的總細(xì)胞密度（單位為細(xì)胞/μl±s.d）。最下方灰色區(qū)域表示冷卻水系統(tǒng)沒(méi)有運(yùn)行的時(shí)間段（控制階段），綠色區(qū)域表示啟動(dòng)，藍(lán)色區(qū)域表示穩(wěn)態(tài)運(yùn)行。

研究結(jié)論：

1. 本文結(jié)合擴(kuò)增子測(cè)序方法（16S rRNA基因）和單細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)）來(lái)定量微生物分類(lèi)單元的絕對(duì)豐度。使用絕對(duì)豐度的縱向分析導(dǎo)致產(chǎn)生與相對(duì)豐度顯著不同的豐度剖面，這些剖面很清楚，可直接用于比較研究。

2. 本文還提供了證據(jù)，證明微生物某一類(lèi)群的富集（相對(duì)豐度比例的增加）不一定真正與相應(yīng)微生物類(lèi)群的生長(zhǎng)（絕對(duì)豐度的增加）有關(guān)，可能是其它微生物類(lèi)群的衰退是導(dǎo)致其在群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度比例的增長(zhǎng)。

3. 這些結(jié)果能夠表明，微生物類(lèi)群的絕對(duì)定量是必不可少的，并且對(duì)微生態(tài)學(xué)內(nèi)許多懸而未決的問(wèn)題具有進(jìn)一步闡明的潛力。同時(shí)本文研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)，對(duì)于微生物學(xué)調(diào)查的全面生物學(xué)解釋?zhuān)瑧?yīng)該同時(shí)考慮絕對(duì)豐富度，而不能僅僅考慮微生物的相對(duì)豐度。