一問(wèn)一答一世界：了解天昊生物微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)

發(fā)稿時(shí)間：2018-11-01來(lái)源：天昊生物

                

Q1: 開發(fā)微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)的初衷是什么？

A:

• 客戶多次提出環(huán)境樣本中指定微生物的絕對(duì)定量需求
• 常規(guī)的qPCR實(shí)驗(yàn)不適用于組成復(fù)雜的環(huán)境樣本，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定
• 特定物種需特定qPCR引物，前期評(píng)估及優(yōu)化難度大
• 針對(duì)環(huán)境樣本指定物種的絕對(duì)定量類型項(xiàng)目有普適性方法

Q2: 目前qPCR技術(shù)在微生物定量研究中的短板是什么？

A: qPCR絕對(duì)定量技術(shù)是將已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品梯度進(jìn)行稀釋，進(jìn)行qPCR檢測(cè)，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品進(jìn)行目的基因qPCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以計(jì)算樣品中物種的絕對(duì)拷貝數(shù)，雖然可以進(jìn)行物種絕對(duì)定量分析，但是特定物種qPCR檢測(cè)需要設(shè)計(jì)特定的引物，對(duì)引物特異性要求較高，且引物優(yōu)化難度較大。

 

Q3: 目前常規(guī)16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)在微生物定量研究中的短板是什么？ 

A: 常規(guī)16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)是針對(duì)所有細(xì)菌共有的16S區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目標(biāo)區(qū)域DNA擴(kuò)增富集后進(jìn)行高通量二代測(cè)序，然后將得到的序列與特定數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確認(rèn)物種，通過(guò)OTUs聚類分析，就可以知道樣品中的細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成和不同細(xì)菌的相對(duì)豐度, 雖然其具有高通量測(cè)序，大數(shù)據(jù)量、低花費(fèi)，可客觀還原菌群結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度比例的巨大優(yōu)勢(shì)，但是其是通過(guò)某一OTU分類單元的序列數(shù)所占總序列數(shù)的比值來(lái)獲得某個(gè)細(xì)菌的相對(duì)豐度比例信息，并不能反映樣本中物種真實(shí)的絕對(duì)豐度情況，因此通過(guò)此技術(shù)得到的結(jié)果說(shuō)X菌在A組相對(duì)于B組增多是錯(cuò)誤的，應(yīng)該是X菌在A組中的豐度比例相對(duì)于B組增多。

 

Q4: 微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序相對(duì)于qPCR絕對(duì)定量技術(shù)和常規(guī)擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)有什么明顯優(yōu)勢(shì)？

A: 微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序是一種將qPCR絕對(duì)定量技術(shù)和常規(guī)擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)合二為一的一種創(chuàng)新性技術(shù)，可以說(shuō)微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序=常規(guī)16S擴(kuò)增子測(cè)序+總細(xì)菌qPCR絕對(duì)定量+特定菌種qPCR絕對(duì)定量，因此通過(guò)微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序既可以解析樣本中總細(xì)菌的絕對(duì)拷貝數(shù)；解析樣本中特定物種的絕對(duì)拷貝數(shù)；也可以進(jìn)行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析和環(huán)境因子分析等常規(guī)擴(kuò)增子測(cè)序分析內(nèi)容。

 

Q5: 微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序的技術(shù)原理是什么？

A: 該方法通過(guò)向樣品DNA中添加已知拷貝數(shù)spike-in人工合成序列，然后將樣本進(jìn)行16S擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序，再根據(jù)spike-in的16S擴(kuò)增子reads數(shù)及其絕對(duì)拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OTU reads數(shù)，計(jì)算出樣品中OTU代表序列對(duì)應(yīng)物種16S rRNA基因絕對(duì)拷貝數(shù)。添加16S spike-in到樣品模板中進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增子高通量測(cè)序較好的解決了環(huán)境樣本中微生物的絕對(duì)定量問(wèn)題，同時(shí)也能得到樣本中的物種組成信息。

 

Q6: 目前微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)的樣本類型和樣本量有哪些要求？

A:目前樣品類型包括：常規(guī)土壤樣本和糞便樣本，其它樣本類型則需要評(píng)估。如果客戶直接送樣本，要求：土壤≥5 g；糞便≥2 g；如果客戶送樣本DNA，要求：總量≥500 ng, 濃度≥20 ng/Μl, 純度：OD260/280=1.7-2.0。

 

Q7: 直接送樣本和送樣本DNA有什么特別需要注意的事項(xiàng)？

A:因?yàn)榭蛻籼峁┑臉颖緞t包括樣本或樣本DNA，所以微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序提供的菌種拷貝數(shù)展現(xiàn)形式統(tǒng)一是：16S基因copies/ ng DNA，而常規(guī)的菌種qPCR絕對(duì)定量文章在菌種拷貝數(shù)的展現(xiàn)形式上則是：16S基因copies/ g樣本，因此為了將微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序獲得的16S基因copies/ ng DNA值能夠?qū)?yīng)到 16S基因copies/ g 樣本上，需提前記錄好以下信息：

• 記錄抽提DNA時(shí)每個(gè)樣本所用量（？g 土壤/糞便），取樣時(shí)盡可能保證所有樣本取樣量一致，且DNA抽提條件完全一致；
• 記錄每個(gè)樣本抽提獲得DNA總量；

 

Q8: 為什么微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)每個(gè)樣本有效序列≥15萬(wàn)條？

A: 這是因?yàn)閟pike-in序列會(huì)占用掉一部分測(cè)序數(shù)據(jù)量，為了保證樣本常規(guī)的5萬(wàn)有效reads數(shù)據(jù)量要求，每個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量需達(dá)15萬(wàn)有效reads。

Q9: 微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)和qPCR絕對(duì)定量技術(shù)對(duì)比如何？

A:

準(zhǔn)確度：我們比較qPCR絕對(duì)定量方法與16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序方法所測(cè)定的同一系列樣本的細(xì)菌總拷貝數(shù)，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：兩組數(shù)據(jù)在0.01水平上顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.955，且兩種方法計(jì)算的細(xì)菌總拷貝數(shù)值較為接近，未超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明通過(guò)微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行微生物絕對(duì)定量是可靠準(zhǔn)確的。

穩(wěn)定性：qPCR定量批次間及樣品重復(fù)間（批次內(nèi)）穩(wěn)定性較差，而16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序目前的項(xiàng)目結(jié)果顯示穩(wěn)定性相對(duì)較好。

特異性：16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序所用的引物是常規(guī)16s 擴(kuò)增子測(cè)序最公認(rèn)的引物，引物特異性很好，并且這一對(duì)引物就可以得到總細(xì)菌和所有菌種的絕對(duì)拷貝數(shù)；而特定菌種qPCR檢測(cè)則需要設(shè)計(jì)特定的引物，對(duì)引物特異性要求較高。

靈敏度：qPCR理論檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到10¹分子，實(shí)際檢測(cè)中，有效靈敏度取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線的菌種豐度下限，受qPCR檢測(cè)平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)方法的限制，通常檢測(cè)下限在10²水平。16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序理論檢測(cè)靈敏度為單分子，實(shí)際檢測(cè)中，有效靈敏度取決于標(biāo)準(zhǔn)曲線的菌種豐度下限，與添加的spike-in總拷貝關(guān)聯(lián)（添加10⁵拷貝：檢測(cè)下限為102拷貝，添加106拷貝：檢測(cè)下限為10³拷貝）。

 

Q10: spike-in序列的添加對(duì)樣本原有群落組成和樣本物種絕對(duì)豐度是否有影響？

A: 

• 以下是比較樣本A三次測(cè)序結(jié)果，三次測(cè)序編號(hào)分別為A_V4（未添加spike-in序列）、Y42_V4（添加10⁶ copies Spike-in序列）、Y4_V4（添加10⁷ copies Spike-in序列）。結(jié)果顯示：Y4_V4、Y42_V4、A_V4樣本優(yōu)勢(shì)菌屬完全一致，且這些菌屬在各個(gè)樣本中的相對(duì)豐度比較一致，說(shuō)明spike-in的添加對(duì)樣本屬水平的群落組成無(wú)明顯影響。

 

圖1 屬（genus）水平群落組成柱狀圖

 

• 比較同一樣本中添加不同比例spike-in DNA測(cè)得物種絕對(duì)拷貝數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加17.4%和63.8% spike-in DNA對(duì)同一樣本的物種16S絕對(duì)拷貝數(shù)的計(jì)算值比較一致，說(shuō)明添加spike-in對(duì)樣本中細(xì)菌進(jìn)行絕對(duì)定量的方法重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好，能夠真實(shí)定量出樣本中各個(gè)物種的絕對(duì)豐度。

 

圖2  優(yōu)勢(shì)OTU代表物種絕對(duì)拷貝數(shù)（Top 10 )

 

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