1.技術簡介：
16S rRNA基因擴增子高通量測序，是通過對基因組目的區(qū)域進行PCR擴增，將目標區(qū)域DNA擴增富集后進行高通量測序的研究策略，可有效研究特定環(huán)境中的物種信息，檢測幾十至幾百種微生物特性。近來，特定環(huán)境樣本中某一類群微生物的絕對定量問題受到越來越多研究學者的關注，以往都是通過特定物種的qPCR絕對定量進行檢測，但qPCR定量實驗結果常常不穩(wěn)定，且特定物種qPCR需要設計特定引物，對引物特異性要求較高，且引物優(yōu)化難度較大，導致常規(guī)的qPCR絕對定量實驗不再適用于組成較為復雜的環(huán)境樣本微生物絕對定量。目前，16S rRNA基因測序手段通過某一OTU分類單元的序列數占總序列數的比值來獲得相對豐度數據，然而相對豐度信息不能反映環(huán)境樣本中物種絕對豐度情況，而基于16S spike-in standards的微生物絕對定量測序恰好能夠獲得環(huán)境樣本中物種的絕對豐度數據。
該方法通過向樣品DNA中添加一定量spike-in standards人工合 成序列，進行16S擴增子文庫構建、測序，再根據spike-in standards 的16S擴增子reads數及其絕對拷貝數繪制標準曲線，計算出樣品中OTU代表序列對應物種16S rRNA基因絕對拷貝數。添加16S spike-in standards到樣品模板中進行16S rRNA基因擴增子高通量測序較好的解決了環(huán)境樣本中微生物的絕對定量問題，同時也能得到環(huán)境樣本中的物種組成信息。
說明：由于該方法需要額外添加外源核算序列，且對樣本的DNA要求也較高，因此目前階段只適合做一些常規(guī)的環(huán)境樣本 (常規(guī)土壤樣本，人糞便樣本)。
2.技術優(yōu)勢
3．應用領域
4.技術參數
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測序類型 |
推薦區(qū)域 |
樣品要求 |
測序策略 |
數據要求 |
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微生物16S擴增子絕對定量測序 |
V3 V4 V3+V4 V4+V5 |
樣品類型：常規(guī)土壤樣本和人糞便DNA，無明顯降解； 樣品需求量：總量>500ng；濃度≥20ng/μL； 純度：OD260/280=1.7-2.0。 |
Illumina 2×250 Illumina 2×150 |
每個樣本有效序列≥15萬條，spike-in序列占總序列10%~50%；Raw data Q30數據達到70%以上，Clean data Q30數據達到80%以上。 |
5.技術路線
6.分析內容
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標準分析 |
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數據統(tǒng)計與優(yōu)化 |
OTU分類分析 |
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原始序列數據統(tǒng)計 |
優(yōu)化序列數據統(tǒng)計 |
OTU聚類分析 |
分類學分析 |
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物種注釋統(tǒng)計 |
進化樹分析 |
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OTU絕對定量 |
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樣本OTU Id對應的物種絕對拷貝數統(tǒng)計 |
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群落組成分析 |
Alpha多樣性分析 |
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單樣本物種組成餅圖 |
單樣本多級物種組成圖 |
多樣性指數分析 |
多樣性指數差異分析 |
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分類學系統(tǒng)組成樹 |
物種總豐度柱狀圖 |
稀釋性曲線 |
Shannon-Wiener曲線 |
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豐度分布Bubble圖 |
多樣本群落結構柱狀圖 |
Rank-Abundance曲線 |
物種累積曲線 |
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樣本聚類樹柱狀圖 |
Heatmap熱圖 |
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Metastats分析 |
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Beta多樣性分析 |
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Venn圖分析 |
樣本聚類樹圖 |
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PCA分析 |
PCoA分析 |
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NMDS分析 |
ADONIS分析 |
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Lefse分析 |
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高級分析項目 |
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環(huán)境因子分析 |
可選分析 |
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Mantel test分析 |
Bioenv分析 |
PD分析 |
3D-PCoA分析 |
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物種與環(huán)境因子相關性分析 |
RDA/CCA分析 |
PLS-DA分析 |
ANOSIM分析 |
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Metagenomeseq分析 |
Wilcoxon秩和檢驗/ANOVA分析 |
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PICRUSt功能分析 |
優(yōu)勢物種網絡圖分析 |
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Indicator分析 |
OTU富集三元相圖 |
7.服務流程
8. 結果展示
1) 樣本OTU代表序列對應物種16S rRNA基因絕對拷貝數計算
a) 16S V4區(qū)擴增子測序的DNA模板中樣品DNA和spike-in DNA添加情況
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模板編號 |
模板中spike-in 拷貝數 |
模板中樣本DNA量 |
樣本信息 |
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Y1_V4 |
2.67E+07 copies |
5 ng |
糞便樣本 |
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Y3_V4 |
2.67E+06copies |
5 ng |
土壤樣本 |
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Y4_V4 |
2.67E+07 copies |
5 ng |
淤泥樣本A |
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Y7_V4 |
2.67E+06copies |
5 ng |
土壤樣本 |
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Y42_V4 |
2.67E+06copies |
5 ng |
淤泥樣本A |
注： Y4_V4和Y42_V4是同一個樣本分別添加2.67E+07 copies和2.67E+06 copies的spike-in DNA后的混合樣本。
b) 根據spike-in序列制作標準曲線（以Y4為例），計算優(yōu)勢OTU代表序列物種起始拷貝數：
表 1 Y4_V4 樣品中spike-in序列數及拷貝數
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spike-in序列編號 |
spike-in序列數 （OTUreads） |
spike-in 拷貝數 （copies） |
spike-in序列數取log log（OTUreads） |
spike-in 拷貝數取log log（copies） |
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spike_1 |
68841 |
1.20E+07 |
4.837847 |
7.079061 |
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spike_2 |
55078 |
1.20E+07 |
4.740978 |
7.079061 |
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spike_3 |
9155 |
1.20E+06 |
3.961658 |
6.079061 |
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spike_4 |
7949 |
1.20E+06 |
3.900312 |
6.079061 |
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spike_5 |
1085 |
1.20E+05 |
3.03543 |
5.079061 |
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spike_6 |
1034 |
1.20E+05 |
3.014521 |
5.079061 |
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spike_7 |
72 |
1.20E+04 |
1.857332 |
4.079061 |
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spike_8 |
66 |
1.20E+04 |
1.819544 |
4.079061 |
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spike_9 |
66 |
1.20E+04 |
1.819544 |
4.079061 |
c) 以log（copies）為橫坐標，log（reads）為橫坐標，制作標準曲線如下：
圖 1 Y4樣品的標準曲線
d) 標準曲線如下根據標準曲線計算的測試樣品中優(yōu)勢OTU序列(Top10)的起始拷貝數：
表2 根據標準曲線計算的測試樣品中優(yōu)勢OTU序列(Top10)的起始拷貝數
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#OTU ID |
Y4_V4 OTUreads |
Y4_V4 copies |
Y4_V4 log（OTUreads） |
Y4_V4 log（copies） |
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OTU60 |
47754 |
7.72E+06 |
4.67901 |
6.887707 |
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OTU8 |
6052 |
9.55E+05 |
3.781899 |
5.980068 |
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OTU73 |
3820 |
6.00E+05 |
3.582063 |
5.777887 |
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OTU63 |
3650 |
5.73E+05 |
3.562293 |
5.757884 |
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OTU72 |
3028 |
4.74E+05 |
3.481156 |
5.675795 |
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OTU71 |
3017 |
4.72E+05 |
3.479575 |
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