Gut：腸道微生物可作為早期肝癌靶向非侵入性診斷標(biāo)志物

發(fā)稿時(shí)間：2018-09-10來(lái)源：天昊生物

     

英文題目: Gut microbiome analysis as a tool towards targeted non-invasive biomarkers for early hepatocellular carcinoma

中文題目：腸道微生物可作為早期肝癌靶向非侵入性診斷生物標(biāo)志物

期刊名：Gut

影響因子： 17.016

發(fā)表時(shí)間：2018年7月

研究背景:

肝癌已經(jīng)成為了所有癌癥中排名第三的“殺手”，根據(jù)2015年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，中國(guó)新發(fā)肝癌病例達(dá)到46.6萬(wàn)，其中男性的數(shù)量約為女性的3倍。發(fā)病率高的同時(shí)，預(yù)后也讓人感到擔(dān)憂，原因之一就在于早期診斷很困難。肝癌因?yàn)槿鄙偬禺愋缘臉?biāo)志物，很多患者確診時(shí)就已經(jīng)是晚期了，死亡率與發(fā)病率的比值能夠達(dá)到0.95。因此，迫切需要新的早期肝癌診斷標(biāo)志物。

研究目的:

• 研究肝癌（HCC）患者腸道菌群特征；
• 尋找肝癌（HCC）非侵襲性微生物診斷標(biāo)志物。

研究對(duì)象：

本研究共收集了來(lái)自華東，華中和西北地區(qū)的486份糞便樣本， 經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病理診斷和排除過(guò)程，完成了419個(gè)樣本16S Miseq測(cè)序，隨機(jī)將其中321個(gè)樣本分為發(fā)現(xiàn)組和驗(yàn)證組：在發(fā)現(xiàn)階段，通過(guò)75例早期肝癌患者、40例肝硬化患者和75例健康對(duì)照進(jìn)行了腸道微生物特征解析；利用早期肝癌患者隊(duì)列與非肝癌患者隊(duì)列（肝硬化患者和健康對(duì)照）進(jìn)行了微生物標(biāo)志物鑒定和肝癌診斷分類器構(gòu)建；在驗(yàn)證階段，接著對(duì)56例健康對(duì)照、30例早期肝癌患者和45例晚期肝癌患者對(duì)肝癌診斷分類器進(jìn)行了驗(yàn)證。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)新疆的18個(gè)肝癌患者和鄭州的80個(gè)肝癌患者對(duì)肝癌診斷分類器進(jìn)行了獨(dú)立診斷驗(yàn)證。

圖1研究設(shè)計(jì)流程圖。

研究結(jié)果：

參與者特點(diǎn)

• 在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中（75例早期肝癌患者、40例肝硬化患者和75例健康對(duì)照）這3組參與者的臨床特征包括年齡、性別和體重指數(shù)是匹配的。相對(duì)于對(duì)照組和肝硬化患者，血清甲胎蛋白水平在早期肝癌患者顯著升高（表1）。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、總膽紅素、直接膽紅素在早期肝癌患者明顯升高，而總蛋白、白蛋白和血小板濃度則顯著降低。

表1發(fā)現(xiàn)階段受試者的臨床特征

糞便形狀和濕度

• 首先基于糞便常規(guī)測(cè)試評(píng)估糞便形態(tài)，并通過(guò)冷凍凍干試驗(yàn)測(cè)量糞便濕度。發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列所有樣本的糞便特征是軟的。發(fā)現(xiàn)階段早期肝癌、肝硬化和健康對(duì)照組之間以及驗(yàn)證階段對(duì)照、早期肝癌、晚期肝癌、新疆和鄭州樣本之間的糞便顏色均無(wú)顯著差異。
• 在糞便水分方面，發(fā)現(xiàn)階段早期肝癌、肝硬化和健康對(duì)照組以及驗(yàn)證階段對(duì)照組、早期肝癌、晚期肝癌、新疆樣本和鄭州樣本之間沒(méi)有顯著差異。

早期肝癌患者腸道微生物多樣性降低

• 相對(duì)于健康對(duì)照組，肝硬化患者腸道微生物多樣性顯著降低；相對(duì)于肝硬化，早期肝癌患者腸道微生物多樣性增加（圖2A）。
• 相對(duì)于健康對(duì)照組，肝硬化患者糞便微生物多樣性指數(shù)（Shannon index, Simpson index and Invsimpson index）顯著降低, 相對(duì)于肝硬化，早期肝癌患者腸道微生物多樣性增加（圖2B-D），
• Venn圖顯示三組共932個(gè)OTU中有524個(gè)共享。值得注意的是，932個(gè)OTU中的90個(gè)對(duì)于早期肝癌患者是特異的（圖2E）。

圖2早期肝癌患者、肝硬化患者和健康對(duì)照的腸道微生物多樣性

糞便微生物群落組成

• 擬桿菌屬、厚壁菌屬和變形桿菌屬占總序列90%以上，為三個(gè)群體中的優(yōu)勢(shì)種群（圖3A）。與肝硬化患者相比，早期肝癌患者的放線菌門明顯增加（圖3C）。而且包括Gemmiger、Parabacteroides和Paraprevotella在內(nèi)的13個(gè)菌屬在早期肝癌患者明顯增加（圖3D）。
• 與健康人相比，早期肝癌患者疣微菌門（Verrucomicrobia）細(xì)菌明顯減少（圖3E），從屬的水平上來(lái)看，包括Alistipes、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）在內(nèi)的12個(gè)屬的細(xì)菌也明顯減少了，與此同時(shí)，包括克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和嗜血菌屬（Haemophilus）在內(nèi)的6個(gè)屬的細(xì)菌則增加了（圖3F-G）。
• 通過(guò)LEfSe分析，肝硬化患者與早期肝癌患者，還有健康人與早期肝癌患者之間的腸道微生物組成有顯著差異，這為建立腸道微生物標(biāo)志物的早期肝癌患斷模型提供了可能。

圖3早期肝癌患者、肝硬化患者和健康對(duì)照腸道微生物組成。

早期肝癌微生物標(biāo)志物的鑒定

• 我們構(gòu)建了一個(gè)隨機(jī)森林分類模型，可以特異性地將非肝癌患者和早期肝癌患者樣本區(qū)分。為了檢測(cè)早期肝癌的特異OTU標(biāo)記，我們通過(guò)發(fā)現(xiàn)階段的75個(gè)早期肝癌和115個(gè)非肝癌樣本（40個(gè)肝硬化和75個(gè)對(duì)照）對(duì)隨機(jī)森林模型進(jìn)行了五重交叉驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30個(gè)OTU標(biāo)記被選為最佳標(biāo)記集（圖4A）。
• 使用發(fā)現(xiàn)的30個(gè)OTU最佳標(biāo)記集對(duì)發(fā)現(xiàn)隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列的POD指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。在發(fā)現(xiàn)階段,非肝癌患者和早期肝癌患者的AUC值為80.64%，95% CI為74.47%～86.8%（圖4B）。早期肝癌樣本與非肝癌樣本相比，POD值顯著增加（圖4C）。這些數(shù)據(jù)表明，基于微生物OTU標(biāo)記的POD對(duì)區(qū)分非肝癌患者和早期肝癌患者樣本具有強(qiáng)大的診斷潛力。

圖4通過(guò)隨機(jī)森林模型鑒定早期肝癌微生物標(biāo)志物

肝癌微生物標(biāo)志物驗(yàn)證與獨(dú)立診斷

• 在驗(yàn)證階段，56個(gè)對(duì)照，30個(gè)早期肝癌和45個(gè)晚期肝癌用于驗(yàn)證POD對(duì)肝癌的診斷功效，計(jì)算每個(gè)患者的每個(gè)POD。
• 30例早期肝癌患者的平均POD值顯著高于56例對(duì)照組，POD的AUC值為76.80％，其驗(yàn)證了對(duì)早期肝癌的診斷潛力（圖5A）。
• 為了說(shuō)明POD對(duì)肝癌的特異性，我們進(jìn)一步招募晚期肝癌患者以驗(yàn)證其診斷潛力。結(jié)果表明，45例晚期肝癌患者的POD值顯著高于56例對(duì)照組（圖5A），晚期肝癌患者（圖5C）AUC值達(dá)到80.40％,這表明對(duì)晚期肝癌具有明顯的診斷功效。
• 為了進(jìn)一步確定POD的診斷潛力和診斷范圍，來(lái)自新疆（中國(guó)西北）的18例肝癌患者和來(lái)自鄭州（中國(guó)中部）的80例肝癌患者作為獨(dú)立診斷來(lái)驗(yàn)證POD可靠性。新疆18例肝癌和鄭州80例肝癌與56例對(duì)照的平均POD值比較具有顯著增加(圖5A)。其中來(lái)自新疆的18例肝癌AUC值達(dá)到79.20%(圖5D)。鄭州80例肝癌的AUC值為81.70%（圖5E）,這些結(jié)果表明基于微生物標(biāo)志物的POD對(duì)中國(guó)西北部和中部地區(qū)肝癌患者有很強(qiáng)的診斷作用。

圖5肝癌微生物標(biāo)志物的驗(yàn)證和獨(dú)立診斷。

研究結(jié)論：

1.  從肝硬化到早期肝癌糞便微生物多樣性增加。

2.  相對(duì)于肝硬化，放線菌門在早期肝癌患者增加，包括Gemmiger、Parabacteroides和Paraprevotella在內(nèi)的13個(gè)菌屬在早期肝癌患者明顯增加。

3.  相對(duì)于對(duì)照，產(chǎn)丁酸屬減少，而產(chǎn)生脂多糖（LPS）的屬在在早期肝癌患者增加。丁酸鹽作為腸粘膜的主要能量來(lái)源，被認(rèn)為是宿主細(xì)胞中基因表達(dá)，炎癥，分化和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)菌能量代謝和腸道健康中起著關(guān)鍵作用。因此，產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌的減少可促進(jìn)腸粘膜破壞，從而有可能促使了肝癌的發(fā)生。LPS的增加引發(fā)各種病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，高水平的LPS激活NF-κB通路，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子（TNF-α，IL-6和IL-1）并導(dǎo)致肝臟炎癥和氧化損傷，從而促使肝癌的發(fā)生。

4.  通過(guò)5次隨機(jī)森林模型的交叉驗(yàn)證，確定了30個(gè)最合適微生物標(biāo)記，在75個(gè)早期肝癌患者和105個(gè)非肝癌患者樣本之間獲得了80.64%的AUC值。

5.  值得注意的是，腸道微生物標(biāo)志物對(duì)早期肝癌患者甚至晚期肝癌患者具有很強(qiáng)的診斷潛力。重要的是，這些微生物標(biāo)記物成功地實(shí)現(xiàn)了在西北和華中地區(qū)肝癌的跨區(qū)域驗(yàn)證。