Am J Respir Crit Care Med：微生物16S擴(kuò)增子測(cè)序+宿主轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的聯(lián)合應(yīng)用

發(fā)稿時(shí)間：2018-08-27來源：天昊生物

英文題目: Airway microbiota is associated with up-regulation of the PI3K pathway in lung cancer

中文題目：呼吸道微生物與肺癌PI3K通路上調(diào)相關(guān)

期刊名：American journal of respiratory and critical care medicine 

影響因子： 12.996 

發(fā)表時(shí)間：2018年6月

研究背景: 

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，超過乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和腎癌的總死亡人數(shù)。雖然吸煙是肺癌的一個(gè)公認(rèn)的危險(xiǎn)因素，但只有15%的吸煙者會(huì)患肺癌。同樣，COPD /肺氣腫是不依賴于吸煙導(dǎo)致肺癌的危險(xiǎn)因素，但是只有15%的吸煙者會(huì)患有COPD /肺氣腫。COPD和肺癌的發(fā)展以慢性炎癥和致病通路重疊為特征。越來越多的證據(jù)表明肺部微生物可能在癌癥的發(fā)病機(jī)制中起作用。肺癌與諸如COPD、HIV和衣原體感染等疾病相關(guān)，其中慢性氣道感染是常見的。例如在無菌實(shí)驗(yàn)大鼠，肺癌的發(fā)展相對(duì)于對(duì)照是相對(duì)較低的。給小鼠長(zhǎng)期給藥脂多糖（LPS）會(huì)導(dǎo)致肺腫瘤的發(fā)生。在小鼠模型中用抗生素破壞共生細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)影響γδT17細(xì)胞應(yīng)答，導(dǎo)致侵襲性肺腫瘤的發(fā)展。使用細(xì)菌16S rRNA測(cè)序，導(dǎo)致人們?cè)絹碓揭庾R(shí)到下呼吸道微生物環(huán)境（統(tǒng)稱為肺微生物群）可能在肺部疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在一項(xiàng)小型隊(duì)列研究中，發(fā)現(xiàn)韋榮球菌屬和巨球型菌屬在肺腺癌患者的下呼吸道中富集。發(fā)現(xiàn)在下氣道中發(fā)現(xiàn)的不同肺微生物群對(duì)宿主的免疫表型有影響。我們還報(bào)道，下呼吸道富集的口腔厭氧菌群（包括韋榮氏菌）與炎癥細(xì)胞（Th17細(xì)胞）的浸潤(rùn)增加和支氣管上皮細(xì)胞ERK/PI3K通路的上調(diào)有關(guān)。重要的是，PI3K通路上調(diào)先前被證明是非小細(xì)胞肺癌的早期發(fā)病事件，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、分化和細(xì)胞侵襲。目前的證據(jù)表明，一種低生物量的下呼吸道微生物群可能通過不同的機(jī)制影響肺癌的發(fā)生，包括誘導(dǎo)宿主炎癥通路，產(chǎn)生細(xì)菌毒素，改變宿主基因組穩(wěn)定性，以及釋放促進(jìn)腫瘤的微生物代謝物。在這項(xiàng)研究中，我們假設(shè)下呼吸道微生物群的破壞與影響PI3K信號(hào)（與肺癌發(fā)病相關(guān)）通路的呼吸道轉(zhuǎn)錄組改變相關(guān)。

研究對(duì)象：

參加者包括胸部影像學(xué)表明有可疑結(jié)節(jié)的患者和接受臨床支氣管鏡檢查的患者。病理組織學(xué)診斷將參與者分為肺癌組（n＝39，診斷為肺癌）、疾病對(duì)照組（n＝36，良性肺結(jié)節(jié)）和健康對(duì)照組（n＝10）（從未吸煙者，經(jīng)支氣管鏡檢查表明無呼吸道癥狀、胸部X射線異?；蚍尾考膊?/span>）。年齡平均為61.2歲，其中男性66%，白人52.9%，吸煙者88.9%，平均煙齡30.9年（表1）。肺癌組（煙齡41.8年），疾病對(duì)照組（煙齡29.3年），健康對(duì)照組由不吸煙者組成。

 

表1：隊(duì)列的人口學(xué)和臨床特征

背景標(biāo)本是在手術(shù)前通過支氣管鏡的抽吸通道輸送無菌鹽水獲得的。在可疑結(jié)節(jié)的情況下，通過細(xì)胞刷收集下氣道樣本：(i) “涉及”疾病氣道；(ii)在可疑結(jié)節(jié)對(duì)側(cè)葉上的“未涉及”疾病氣道。在健康對(duì)照組，通過支氣管鏡檢查獲得“未涉及”疾病的下氣道刷樣本。RNAseq樣本是通過氣道刷獲得的支氣管上皮細(xì)胞。

 

補(bǔ)充圖E1：采樣方法示意圖。

體外上皮細(xì)胞暴露

A549細(xì)胞系和細(xì)菌菌株Prevotella melaninogenica (ATCC#25845)、Streptococcus mitis(ATCC#49456)和Veillonella parvula(ATCC #10790)被用來評(píng)估相互作用。每個(gè)呼吸道上皮細(xì)胞（1x10 6， 2毫升培養(yǎng)基中）暴露于以下每種條件下總共4小時(shí)：支氣管肺泡液（BAL，100μl），10ng/ml LPS，50μl細(xì)菌上清液，10μl熱滅活細(xì)菌，或單獨(dú)的稀釋緩沖液（對(duì)照）。香煙煙霧冷凝液（40μg/ml）加入或不加入細(xì)菌產(chǎn)物。

技術(shù)平臺(tái)：細(xì)菌16S測(cè)序區(qū)段（V4）；RNA-seq 

研究結(jié)果：

下呼吸道轉(zhuǎn)錄組的評(píng)價(jià)

• PCoA分析顯示所涉及的癌癥組、疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組之間有顯著差異（圖1A）。KEGG第3級(jí)通路評(píng)價(jià)了癌癥組、疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組功能通路的差異：與對(duì)照組相比，“涉及”肺癌樣本具有顯著上調(diào)的信號(hào)通路，包括Hippo、MAPK、TNF、Toll樣受體、T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體、上皮細(xì)胞細(xì)菌侵襲、結(jié)直腸癌和幽門螺桿菌途徑的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路（圖1B）。然后，我們?cè)u(píng)估了癌癥組、疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組之間轉(zhuǎn)錄基因數(shù)據(jù)的功能富集，重點(diǎn)是差異表達(dá)基因。與疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組相比，癌癥組有較強(qiáng)的PI3K/AKT和ERK/MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)（圖1C）。使用基因集富集分析（GSEA），我們比較了（肺癌組與疾病對(duì)照組）轉(zhuǎn)錄組與先前公布的數(shù)據(jù)集，結(jié)果表明基因表達(dá)有顯著的重疊，先前觀察到的肺癌患者下呼吸道p53、PI3K、EGF受體、Ras等信號(hào)通路被誘導(dǎo)得到重現(xiàn)（圖1D）。

 

圖1 癌癥組、疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組之間的氣道轉(zhuǎn)錄組差異

16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)

• 共190個(gè)氣道樣本（頰和下呼吸道）用于分析16S rRNA基因序列。在120個(gè)下呼吸道樣本中，62個(gè)來自“涉及”疾病的樣本，而58個(gè)來自“未涉及”疾病的樣本。所有190個(gè)氣道樣本和72個(gè)背景樣本（附圖E6A）的分層聚類顯示，一些氣道樣本富含口腔厭氧菌，例如Prevotella、Streptococcus和韋榮氏菌，而其他氣道標(biāo)本則富含背景樣品中常見的類群。并且這種分層聚類與下氣道或頰部樣本的癌癥狀態(tài)無關(guān)（附圖E6B）。

 

補(bǔ)充圖E6：下呼吸道微生物組成的主要差異

• PCoA分析顯示樣本位置類型不同，樣品的β-多樣性有顯著差異（附圖E7A）。

補(bǔ)充圖E7：不同類型樣品之間微生物組分的差異。

 

• 癌和非癌狀態(tài)的口腔頰樣本的α和β多樣性無明顯差異（補(bǔ)充圖E8A）。

 

補(bǔ)充圖E8：不同樣本類型的癌和非癌狀態(tài)α和β多樣性比較

 

• 然而，在下呼吸道樣本中，癌癥組和非癌癥組（疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組）在β-多樣性上有顯著差異（圖2A）。LEfSe確定了癌癥組與兩個(gè)對(duì)照組之間的分類差異（圖2B）。與疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組相比，“涉及”癌癥氣道樣品富集Streptococcus,Veillonella。疾病對(duì)照組富集Streptophyta, Moraxellaceae, Stenotrophomonas，而健康對(duì)照樣品富集Acholeplasma, Acidocella。

圖2：癌癥組、疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組之間氣道微生物的差異

 

多組學(xué)分析

• 為了更好解析這個(gè)隊(duì)列中的宿主/微生物相互作用，我們使用了多組學(xué)分析方法，結(jié)合微生物和宿主上皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。首先，利用DMM模型建立了適合于16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)的兩個(gè)簇。
• LEfSe分析鑒定到在2個(gè)簇差異富集的菌群（補(bǔ)充圖E12A），在一個(gè)簇中，富集了Streptococcus, Prevotella, Veillonella, Rothia等口腔類群（附圖E12B），我們稱之為“簇SPT”（頰優(yōu)勢(shì)類群）。在另一個(gè)簇中，富集了Xanthomondaceae, Staphylococcus, Corynebacterium, Methylobacterium，Granulicatella，我們稱之為“簇BPT”（背景優(yōu)勢(shì)類群）。肺癌患者的下呼吸道樣本更常見的是SPT型微生物群（補(bǔ)充圖E11C）。
• 接著我們研究了這兩個(gè)不同微生物群相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組差異。在SPT和BPT的2458個(gè)差異表達(dá)基因中，1605個(gè)基因在SPT中表達(dá)上調(diào)。利用IPA進(jìn)行功能富集分析表明，ERK1／2和PI3K信號(hào)通路（補(bǔ)充圖E12C）是差異最大的。

 

補(bǔ)充圖E12:兩個(gè)不同的微生物群及其與PI3K/ERK通路上調(diào)的聯(lián)系。

• 隨機(jī)森林分類器表明，在預(yù)測(cè)肺癌的菌群中，最豐富的屬是Prevotella, Veillonella, Streptococcus。
• CompPLS用于鑒定來自簇SPT的豐富屬和肺癌相關(guān)信號(hào)通路之間的聯(lián)系。結(jié)果在幾個(gè)口腔常見菌與ERK/MAPK、PI3K/AKT、TGF-β、p53、NFκB和其他癌癥相關(guān)信號(hào)通路之間發(fā)現(xiàn)了顯著的正相關(guān)性（圖3）。調(diào)整吸煙狀態(tài)并沒有改變模型中的菌群-信號(hào)途徑關(guān)聯(lián)。確定與癌癥相關(guān)途徑顯著相關(guān)的最豐富菌群是Megasphaera和Veillonella，這些菌為口腔常見菌，并在肺型SPT中發(fā)現(xiàn)。

 

圖3：微生物與轉(zhuǎn)錄組之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

呼吸道上皮細(xì)胞與細(xì)菌產(chǎn)物的體外共培養(yǎng)

• 探討隊(duì)列中細(xì)菌暴露與氣道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄變化的可能因果關(guān)系，我們使用A549細(xì)胞進(jìn)行了三個(gè)暴露于微生物產(chǎn)物的體外實(shí)驗(yàn)（圖4A）。在體外實(shí)驗(yàn)1中，我們使用了從對(duì)照組一個(gè)亞組（n＝8，未涉及疾病）得到的支氣管肺泡液中的所有微生物群。這些BAL樣品可以分為：1）富含背景優(yōu)勢(shì)類群（BPT）；2）富含低細(xì)菌載量的頰優(yōu)勢(shì)類群（SPT低）； 3）富含高細(xì)菌載量的頰優(yōu)勢(shì)類群（SPT高），然后，將A549細(xì)胞暴露于上述條件（BPT, SPT low , SPT high，PBS control）4小時(shí)，隨后收獲RNA。與PBS相比，BPT沒有改變轉(zhuǎn)錄水平，然而，在SPT（low and high）中，ERK、IL17、PI3K和VEGF信號(hào)通路上調(diào)，PTEN信號(hào)通路下調(diào)（圖4B和4C），這表明轉(zhuǎn)錄組的改變主要是由頰細(xì)菌類群的微生物產(chǎn)物所驅(qū)動(dòng)。
• 接下來我們將呼吸道上皮細(xì)胞暴露于SPT類群發(fā)現(xiàn)的活菌上清液或熱致死細(xì)菌中（體外實(shí)驗(yàn)2）。暴露于Veillonella上清液或暴露于熱滅活細(xì)菌都會(huì)導(dǎo)致ERK、PI3K和IL17A信號(hào)通路的上調(diào)（圖4B和4D）。LPS和Prevotella或Streptocccus的上清液沒有上調(diào)PI3K暗示激活途徑的差異。有趣的是，Veillonella上清液、熱滅活Veillonella和熱滅活Prevotella都使IL-1β、IL-18、Casp1和NLRP1上調(diào)，表明炎性體可能在這些條件下識(shí)別出一些免疫活性微生物產(chǎn)物（圖4B）。
• 最后，我們探討了微生物與香煙煙霧凝聚物（CSC）的結(jié)合作用（體外實(shí)驗(yàn)3）。首先，單獨(dú)加入CSC導(dǎo)致芳烴受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和ERK1/2和PI3K信號(hào)通路的上調(diào)。在暴露于CSC的A549上皮細(xì)胞中添加細(xì)菌產(chǎn)物導(dǎo)致ERK1/2相關(guān)基因和PI3K信號(hào)通路進(jìn)一步上調(diào)（圖4B和4E）。綜上所述，這些研究結(jié)果表明，暴露于口腔常見菌可能會(huì)進(jìn)一步增加轉(zhuǎn)錄變化，從而超出香煙煙霧的影響。
• GSEA分析表明，在人群中鑒定的癌癥轉(zhuǎn)錄組特征與體外轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間的重疊程度。在體外實(shí)驗(yàn)條件下，與人類肺癌轉(zhuǎn)錄組變化共同的基因超過100個(gè)（圖4F），這些基因涉及p53、細(xì)胞凋亡、p38 MAPK和EGFR信號(hào)通路。

 

 

圖4：呼吸道上皮細(xì)胞暴露于細(xì)菌產(chǎn)物的體外轉(zhuǎn)錄激活

研究結(jié)論：

1. 癌癥患者下呼吸道轉(zhuǎn)錄組與對(duì)照組相比有顯著性差異，包括ERK和PI3K信號(hào)通路的上調(diào)。

2. 肺癌患者的下呼吸道富含口腔菌群（Streptococcus和Viunnela），這與ERK和PI3K信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)。

3. 呼吸道上皮細(xì)胞在體外暴露于Veillonella, Prevotella, Streptococcus引起了同樣ERK和PI3K通路的上調(diào)。