天昊客戶再發(fā)重磅研究 CNVplex?助力登陸Gastroenterology (IF:20.773)

發(fā)稿時(shí)間：2018-08-08來(lái)源：天昊生物

 

近日，天昊生物CNVplex^?高通量DNA拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)助力蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京蛋白質(zhì)組研究中心周鋼橋教授和賀福初院士課題組，在著名胃腸病學(xué)雜志Gastroenterology(IF:20.773)上發(fā)表了題為“Germline Duplication of SNORA18L5 Increases Risk for HBV-related Hepatocellular Carcinoma by Altering Localization of Ribosomal Proteins and Decreasing Levels of p53”的研究。研究團(tuán)隊(duì)基于CNV的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)染色體15q13.3位點(diǎn)的擴(kuò)增（15q13.3 duplication）增加了乙肝病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌（HBV-related HCC）患病風(fēng)險(xiǎn)，而該位點(diǎn)的小核仁RNA(snoRNA) SNORA18L5促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展，并從機(jī)制上逐步深入分析了SNORA18L5參與的促進(jìn)HCC形成的過程，以下是這篇文章的具體內(nèi)容。

 

 

文章題目：Germline Duplication of SNORA18L5 Increases Risk for HBV-related Hepatocellular Carcinoma by Altering Localization of Ribosomal Proteins and Decreasing Levels of p53

期刊：Gastroenterology (IF:20.773)

接收時(shí)間：2018年4月19日

發(fā)表時(shí)間：2018年8月

 

研究背景

很多證據(jù)表明遺傳因素能夠影響乙肝病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌（HBV-related HCC）的易感性，現(xiàn)有的研究主要基于SNP的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）分析HCC的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。除了SNP之外，CNV也與多種常見疾病有關(guān)聯(lián)，然而針對(duì)germline水平的CNV和HBV-related HCC并沒有相關(guān)的GWAS分析。因此本研究在中國(guó)人群中基于CNV的多階段GWAS分析拷貝數(shù)變異是否會(huì)影響HBV-related HCC的風(fēng)險(xiǎn)。

 

GWAS研究思路及主要結(jié)果

1. GWAS研究結(jié)果及分析：

GWAS發(fā)現(xiàn)階段，利用先前研究的芯片數(shù)據(jù)分兩步策略尋找CNV的關(guān)聯(lián)：確定的常見拷貝數(shù)多態(tài)性（CNPs）+新的未被確定的CNV分型，最后確定14個(gè)CNV位點(diǎn)與HBV-related HCC顯著相關(guān)（圖1）。

驗(yàn)證階段，首先利用天昊生物CNVplex^?技術(shù)對(duì)14個(gè)CNV位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅一個(gè)CNV，低頻的15q13.3位點(diǎn)的擴(kuò)增（15q13.3 duplication）與前期結(jié)果一致（圖2A）。然后利用qPCR技術(shù)在獨(dú)立的三組實(shí)驗(yàn)中分別驗(yàn)證該位點(diǎn)的拷貝數(shù)，重復(fù)性均較好。結(jié)合五個(gè)階段的case-control分析，15q13.3位點(diǎn)的擴(kuò)增在case和control中的頻率分別為2.3%（36/1562）和0.2%（3/1533），與HBV-related HCC顯著相關(guān)（p = 3.17×10^-8，OR = 12.02）。

然后需要確定15q13.3 duplication是否為可遺傳的變異，利用芯片對(duì)205個(gè)家系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其中6個(gè)后代存在15q13.3位點(diǎn)的重復(fù)，而且均遺傳自他們的父母，表明了該位點(diǎn)的可遺傳性。

 

圖1 GWAS發(fā)現(xiàn)階段及驗(yàn)證階段研究策略

研究人員利用原位雜交證實(shí)了15q13.3 duplication的存在（圖2B），而且多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果也驗(yàn)證了這個(gè)位點(diǎn)在case和control中的突變頻率與現(xiàn)有結(jié)果一致（圖2C）。

 

圖2 15q13.3 duplication基因組定位

2. 15q13.3 duplication的精細(xì)定位及基因確定

結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)和qPCR結(jié)果將15q13.3 duplication精細(xì)定位在最小為15.4 Kb的區(qū)域（29,997,395-30,012,769 bp），但是該區(qū)域中并沒有蛋白編碼基因，而是有一個(gè)小的核仁RNA(snoRNA) SNORA18L5（圖2C）。qPCR結(jié)果顯示在單核細(xì)胞樣本中SNORA18L5表達(dá)水平與其germline水平的拷貝數(shù)呈正相關(guān)（R = 0.85，p < 0.0001，圖2D），SNORA18L5是15q13.3 duplication區(qū)域一個(gè)合適的候選基因。

3. SNORA18L5基因表達(dá)和功能初探

與對(duì)照細(xì)胞或非瘤組織相比，SNORA18L5在多種HCC細(xì)胞系或組織中均表達(dá)上調(diào)（圖3A）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SNORA18L5啟動(dòng)子區(qū)域存在較高水平的H3K4me3修飾，兩者存在正相關(guān)（圖3B，3C）；使用MLL抑制劑處理HepG2細(xì)胞的時(shí)候，H3K4me3的富集及SNORA18L5表達(dá)水平均會(huì)下降（圖3D）。而且高表達(dá)的SNORA18L5與高AFP水平、較大的腫瘤尺寸、較晚TNM分期、微血管侵入均有顯著相關(guān)性（圖3E）；SNORA18L5高表達(dá)的HCC患者預(yù)后更差（圖3F）。這些結(jié)果進(jìn)一步說明SNORA18L5可能是15q13.3 duplication的一個(gè)功能基因。

 

圖3 SNORA18L5上調(diào)受組蛋白修飾調(diào)控并且與HCC較差預(yù)后相關(guān)

4. SNORA18L5通過加速G1/S期轉(zhuǎn)變及抑制凋亡從而促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)

在L-02和HepG2細(xì)胞中過表達(dá)SNORA18L5后顯著增加細(xì)胞增殖和菌落形成（圖4A，4B），in vivo結(jié)果也顯示過表達(dá)后腫瘤體積的增大（圖4C）。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的SNORA18L5加速G1/S期轉(zhuǎn)變（圖4E），而且在H₂O₂處理HCC細(xì)胞后顯示出抗凋亡的影響（圖4F）。

 

圖4 SNORA18L5促進(jìn)HCC腫瘤形成

5. SNORA18L5詳細(xì)調(diào)控機(jī)制

SNORA18L5過表達(dá)的細(xì)胞中成熟的18S和28S rRNAs水平顯著更高（圖5C），核糖體的合成也顯著增加（圖5E），而且在Act.D處理的細(xì)胞中過表達(dá)SNORA18L5能夠顯著減弱rRNA加工缺陷（圖5D）。因此SNORA18L5的出現(xiàn)能夠通過促進(jìn)rRNA成熟從而減弱核糖體合成的壓力。

 

圖5 SNORA18L5通過促進(jìn)rRNA成熟從而減弱核糖體合成的壓力

因?yàn)楹颂求w合成的缺陷會(huì)導(dǎo)致p53較穩(wěn)定的狀態(tài)并且誘導(dǎo)基于p53對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，因此團(tuán)隊(duì)針對(duì)SNORA18L5和p53之間的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SNORA18L5的存在抑制p53積累，依賴p53起到oncogene的作用。最后還發(fā)現(xiàn)SNORA18L5通過維持RPL5和RPL11兩種核糖體蛋白（RP）在核內(nèi)來(lái)調(diào)控MDM2，SNORA18L5又促進(jìn)MDM2調(diào)控的p53泛素化和降解（圖6，詳見參考文獻(xiàn)）。

 

圖6 SNORA18L5在HCC腫瘤發(fā)生過程中的功能模型

 

 

結(jié)論

在中國(guó)人群中基于多階段germline CNV的GWAS研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)低頻的15q13.3 duplication與HBV-related HCC的易感性相關(guān)，而且驗(yàn)證了SNORA18L5作為這個(gè)風(fēng)險(xiǎn)的CNV的靶點(diǎn)，通過促進(jìn)rRNA的成熟，減弱核糖體合成壓力-RPs-MDM2-p53信號(hào)通過實(shí)現(xiàn)其oncogene的功能。

 

特別感謝

天昊生物特別感謝蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京蛋白質(zhì)組研究中心周鋼橋教授和賀福初院士課題組對(duì)天昊生物技術(shù)和服務(wù)的認(rèn)可！天昊生物將長(zhǎng)期致力于為分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究者提供高質(zhì)量的科研策略咨詢、實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)和遺傳數(shù)據(jù)分析，幫助廣大科研人員獲得更為優(yōu)質(zhì)的科研成果！

 

本成果參考文獻(xiàn)

Cao P, Yang A, Wang R, Xia X, Zhai Y, Li Y, Yang F, Cui Y, Xie W, Liu Y, Liu T, Jia W, Jiang Z, Li Z, Han Y, Gao C, Song Q, Xie B, Zhang L, Zhang H, Zhang J, Shen X, Yuan Y, Yu F, Wang Y, Xu J, Ma Y, Mo Z, Yu W, He F, Zhou G, Germline Duplication of SNORA18L5 Increases Risk for HBV-related Hepatocellular Carcinoma by Altering Localization of Ribosomal Proteins and Decreasing Levels of p53, Gastroenterology (2018), doi: 10.1053/j.gastro.2018.04.020.