Genome Biology：IBD患者盆腔囊處宿主基因表達(dá)，黏膜微生物和臨床結(jié)果的相關(guān)性分析

發(fā)稿時(shí)間：2018-05-31來(lái)源：天昊生物

 

英文題目： Associations between host gene expression, the mucosal microbiome, and clinical outcome in the pelvic pouch of patients with inflammatory bowel disease

期刊名：Genome Biology             影響因子：11.313

研究背景：

囊袋炎是潰瘍性結(jié)腸炎（UC）回腸袋肛管吻合手術(shù)（IPAA）后常見(jiàn)的并發(fā)癥，與炎癥性腸?。?/span>IBD）相似，宿主遺傳學(xué)和微生物也參與到其發(fā)病機(jī)制中。本研究對(duì)患有潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和家族性腺瘤性息肉病（FAP）的IPAA患者配對(duì)活檢樣本進(jìn)行宿主轉(zhuǎn)錄組和16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)分析。

研究流程：

 

研究結(jié)果：

宿主上皮組織基因表達(dá)、腸組織菌群結(jié)構(gòu)、隊(duì)列特征和臨床表型的多因素聯(lián)合分析模型

為了更好地了解IPAA手術(shù)（IPAA是一種能有效治療潰瘍性結(jié)腸炎的手術(shù)方式。它通過(guò)切除全部大腸以及部分肛管,再用回腸末端做成一個(gè)儲(chǔ)袋-當(dāng)成新的直腸用,并與保留下來(lái)的肛門括約肌進(jìn)行吻合，該術(shù)式在移除病灶的同時(shí)，又能保留正常的排便功能）后宿主和微生物之間的關(guān)系，我們?cè)谝粋€(gè)大型元數(shù)據(jù)豐富的橫斷面隊(duì)列中，利用微陣列和16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序分別檢測(cè)了宿主基因表達(dá)和菌群結(jié)構(gòu)，隊(duì)列包括265名患者（51%是女性），年齡在18-78歲之間（表1），手術(shù)治療的UC或FAP患者被納入其中，所有患者在活檢樣本收集前至少1年進(jìn)行IPAA手術(shù)。根據(jù)臨床結(jié)果患者分為家族性腺瘤性息肉（FAP）、無(wú)結(jié)腸袋炎（NP）、急性結(jié)腸袋炎（AP）、慢性結(jié)腸袋炎（CP）或克羅恩病類炎癥（CDL）。大多數(shù)患者在囊袋（Pouch，P）和前袋回腸（PPI）處進(jìn)行了活檢，共包括196個(gè)PPI 樣本和59個(gè)pouch樣本。

 

表1  IPAA隊(duì)列的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征

組織間宿主基因表達(dá)變異度高而菌群變異度低

我們觀察到囊袋（Pouch，P）和前袋回腸（PPI）之間的菌群結(jié)構(gòu)類似，但是它們之間的轉(zhuǎn)錄水平差異很大。

隊(duì)列多組學(xué)整合的降維方法

為了提高菌群組成與宿主轉(zhuǎn)錄活性關(guān)聯(lián)的效率，我們降低了宿主和微生物特征的維數(shù)。我們首先計(jì)算出，如果微生物豐度和基因表達(dá)數(shù)據(jù)之間的協(xié)方差是0.5，使用Bonferroni校正最多執(zhí)行10 ⁴配對(duì)檢驗(yàn)，并保留90%的power和α等于0.05，因此非常有必要將19908個(gè)宿主轉(zhuǎn)錄本和6999個(gè)觀察到的OTUs減少到10 ⁴次測(cè)試，大約是100個(gè)轉(zhuǎn)錄本和100個(gè)微生物clades。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，首先我們對(duì)OTUs分析僅限于那些存在于多個(gè)個(gè)體并且豐富的OTUs（平均豐度＞0.005）；其次在下游分析之前，我們采用了進(jìn)一步的無(wú)監(jiān)督和監(jiān)督策略來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，包括多元線性建模（旨在將微生物與宿主相關(guān)聯(lián)）和線性判別分析（確定哪些微生物和轉(zhuǎn)錄物能用于臨床結(jié)果判別）（圖1）。

• 對(duì)于微生物數(shù)據(jù)的無(wú)監(jiān)督降維，OTUs通過(guò)豐度過(guò)濾之后，使用變異度穩(wěn)定的弧平方轉(zhuǎn)換，然后使用主成分分析將這些過(guò)濾后豐富的分支減少到9個(gè)主成分分支（cPCs），每個(gè)cPC代表一種微生物豐度高度相關(guān)模式（圖1B下）。
• 對(duì)于微生物數(shù)據(jù)的監(jiān)督降維，我們通過(guò)分層聚類進(jìn)一步減少了過(guò)濾的微生物分支列表，然后選擇代表每個(gè)聚類的最低平均豐度，最后使微生物分支數(shù)減少到45個(gè)（圖1C下）。
• 對(duì)于轉(zhuǎn)錄本的無(wú)監(jiān)督降維，首先過(guò)濾所有的宿主轉(zhuǎn)錄物除去那些在所有受試者中表達(dá)變化劇烈的基因。接下來(lái)使用主成分分析將剩余的11945個(gè)宿主轉(zhuǎn)錄本減少到9個(gè)轉(zhuǎn)錄本主成分（gPCs），每個(gè)gPCs代表一種轉(zhuǎn)錄本豐度高度相關(guān)模式（圖1B上）。
• 對(duì)于轉(zhuǎn)錄本的監(jiān)督降維，專注于特定感興趣的宿主基因，特別是那些先前涉及IBD，囊性或宿主-微生物相互作用的宿主基因。因此找到174個(gè)IBD相關(guān)基因，272個(gè)細(xì)菌相互作用基因和12個(gè)囊性相關(guān)基因，這些基因的表達(dá)譜分為75個(gè)基因中心medoids，每一個(gè)代表一個(gè)或多個(gè)表達(dá)相似的基因（圖1C上）。

通過(guò)這些數(shù)據(jù)降維方法，我們將19908個(gè)宿主轉(zhuǎn)錄物和6999個(gè)觀察到的OTUS轉(zhuǎn)化為138個(gè)特征：9個(gè)轉(zhuǎn)錄本主成分和9個(gè)微生物主成分分支，此外還有75個(gè)基因medoids和45個(gè)微生物分支。

 

圖1  數(shù)據(jù)分析流程圖。

組織位置和抗生素使用分別導(dǎo)致宿主基因表達(dá)和微生物組成最大變化

為了使gPCs、cPCs、感興趣的基因中心medoids、炎癥、抗生素使用和臨床結(jié)果之間關(guān)系的可視化，我們生成了一個(gè)雙標(biāo)圖（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗生素使用與慢性口腔炎（chronic pouchitis）表型和腸球菌（Enterococcus）豐度高度相關(guān)。gPC8與抗生素使用呈負(fù)相關(guān)?？肆_恩病類炎癥（Crohn’s disease-like）與腸桿菌科細(xì)菌（Enterobacteriaceae）增多有關(guān)。gPC9高表達(dá)與豐富的Sutterella和有益梭菌（Clostridia）相關(guān)。gPC1、gPC9、gPC6與FAP和無(wú)結(jié)腸袋炎（NP）最密切相關(guān)。

 

圖2 微生物分支、宿主轉(zhuǎn)錄本和臨床數(shù)據(jù)的雙標(biāo)圖。紫色代表微生物，棕色和藍(lán)色箭頭分別代表宿主轉(zhuǎn)錄本和臨床數(shù)據(jù)（包括抗生素使用和臨床結(jié)果，例如FAP、AP、NP），樣品根據(jù)炎癥進(jìn)行顏色區(qū)分，其范圍從無(wú)（綠色）到高（紅色），這個(gè)圖示僅基于PPI樣本。

接著我們量化了被樣本位置（囊袋和前袋回腸）、臨床結(jié)果、抗生素使用和炎癥影響的微生物和總宿主轉(zhuǎn)錄本的比例（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)宿主轉(zhuǎn)錄與樣本位置密切相關(guān)，其次是炎癥，而與抗生素使用幾乎沒(méi)有關(guān)聯(lián)，與此相反，微生物的差異與抗生素密切相關(guān)，但與炎癥或樣本位置關(guān)系不大。

 

表2 炎癥、抗生素、臨床結(jié)果和樣本位置對(duì)轉(zhuǎn)錄組和微生物的影響

為了進(jìn)一步研究抗生素、樣本位置、臨床結(jié)果和炎癥對(duì)特定微生物分支的影響，以及觀察這些受影響的微生物分支系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們進(jìn)行了獨(dú)立的單變量分析（LEfSe）（圖3）。與抗生素使用有關(guān)的Bacteroides, Firmicutes, Tenericutes的豐度廣泛減少，與抗生素使用有關(guān)的Bacilli，Gammaproteo的豐度增加。埃希氏菌屬（Escherichia）與炎癥呈正相關(guān)，放線菌（Actinobacteria）與炎癥呈負(fù)相關(guān)?？紤]使用抗生素后，Sutterella屬和Bacteroidetes屬與FAP臨床結(jié)果也強(qiáng)烈相關(guān)。Actinomycetales，F(xiàn)lavobacteria與PPI弱相關(guān)。

 

圖3單變量分析中的微生物和臨床數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。隊(duì)列中的主要臨床數(shù)據(jù)是抗生素使用，炎癥，組織（pouch或PPI），和臨床結(jié)果（AP，NP，CP，FAP或CDL）。在抗生素使用分層之后，對(duì)炎癥（環(huán)2）、組織類型（環(huán)3）和臨床結(jié)果（環(huán)4, 5和6）的影響LDA值分別計(jì)算。環(huán)的顏色強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于LDA效應(yīng)顯著的分類水平，從門（最小強(qiáng)度）到屬（最大強(qiáng)度）。

寄主基因表達(dá)不是囊袋（pouch）菌群組成的主要決定因素

在數(shù)據(jù)降維之后，為了檢測(cè)基因-微生物的關(guān)聯(lián)，使用多元線性模型來(lái)控制炎癥、組織位置和抗生素使用的影響。監(jiān)督（curated gene）和無(wú)監(jiān)督（gPC/cPC）列表分別獨(dú)立地通過(guò)MaAsL運(yùn)行，結(jié)果只有無(wú)監(jiān)督列表的結(jié)果是顯著的（圖4）。與cPCs顯著相關(guān)的gPCs只有g(shù)PC8 和gPC9（圖4）。gPC9中補(bǔ)體級(jí)聯(lián)（CFI、C2和CFB）、干擾素調(diào)節(jié)因子1、干擾素誘導(dǎo)鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白和白細(xì)胞趨化因子CCL2的表達(dá)減少，預(yù)示gPC9高表達(dá)可能是對(duì)應(yīng)于較低的炎癥狀態(tài)，事實(shí)上，當(dāng)樣品按臨床結(jié)果分層時(shí)，gPC9在克羅恩病炎癥患者中表達(dá)最低，在FAP患者中表達(dá)最高。gPC8中脂多糖激活p38MAP激酶MAP2K6和PLA2G10的表達(dá)減少，這兩個(gè)元件涉及鈣和脂肪介導(dǎo)的炎癥信號(hào)，因此gPC8也可能與炎癥有關(guān)。

只有四個(gè)微生物cPCs與gPC8，gPC9相關(guān)：分別是cPC1, cPC3, cPC6, cPC8。cPC1顯示了明顯與抗生素使用相關(guān)的幾個(gè)特征：腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量增加，擬桿菌屬和厚壁菌屬?gòu)V泛減少，腸球菌數(shù)量最多（圖4）。cPC3具有最低水平的雙歧桿菌。cPC1和cPC3與gPC8和gPC9呈負(fù)相關(guān), 這些模式表明這組具有抗生素特征的微生物與潛在的炎癥基因高表達(dá)相關(guān)。

總之，宿主轉(zhuǎn)錄物和微生物之間的線性關(guān)系一般是適度的，占總變異的大約25%，因?yàn)槠渥儺愔饕怯山M織位置和抗生素使用分別驅(qū)動(dòng)的。

圖4 多元線性模型結(jié)果。主成分分析將數(shù)據(jù)減少到9個(gè)gPCs（左側(cè)）和9個(gè)cPCs（中間），橙色和藍(lán)色分別表示表達(dá)的增加或減少。右側(cè)是同時(shí)控制炎癥、組織位置和抗生素使用影響后cPCs 和gPCs之間的關(guān)聯(lián)分析。

用宿主-微生物混合模型分鑒定pouch結(jié)果

接下來(lái)想探討宿主轉(zhuǎn)錄本、微生物或某些組合是否可用于臨床結(jié)果診斷。因?yàn)榭股厥褂迷谂R床結(jié)果中高度不均衡，并且對(duì)慢性口腔炎的預(yù)后具有高度預(yù)測(cè)性，因此我們將分析限制在沒(méi)有抗生素使用的樣本中。慢性結(jié)腸袋炎（CP）和克羅恩病類炎癥（CDL）可以通過(guò)這個(gè)模型有效區(qū)分，特別是FAP（圖5）。然而交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確性較低（AUC 0.57），主要是由于模型對(duì)AP和NP結(jié)果的低區(qū)分度造成的。

 

圖5針對(duì)臨床結(jié)果的線性鑒別分析。使用線性鑒別分析來(lái)確定在控制抗生素使用后，哪些基因和微生物在臨床結(jié)果上最具鑒別力。在分析之前除去抗生素使用的所有樣品，并使用LDA混合模型進(jìn)行一次性交叉驗(yàn)證。（A，B）使用LD1和LD2鑒別臨床結(jié)果。

研究結(jié)果：

• 這項(xiàng)研究量化了炎癥、抗生素使用和活檢位置對(duì)囊袋菌群和宿主轉(zhuǎn)錄組的影響，發(fā)現(xiàn)宿主轉(zhuǎn)錄物主要與活檢部位和炎癥相關(guān)，而微生物主要與抗生素使用相關(guān)。
• 宿主轉(zhuǎn)錄物和微生物之間的線性關(guān)系一般是適度的，只占總變異的大約25%，因?yàn)槠渥儺愔饕怯山M織位置和抗生素使用分別驅(qū)動(dòng)的。
• 與微生物最相關(guān)的宿主轉(zhuǎn)錄過(guò)程是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)基因和白介素-12通路。
• 這些宿主轉(zhuǎn)錄過(guò)程的激活與Sutterella, Akkermansia, Bifidobacteria, Roseburia豐度呈負(fù)相關(guān)，與Escherichia豐度呈正相關(guān)。