Microbiome：健康足月妊娠羊水不含可檢測(cè)的微生物群落

發(fā)稿時(shí)間：2018-05-22來源：天昊生物

英文題目： Amniotic fluid from healthy term pregnancies does not harbor a detectable microbial community

期刊名：Microbiome          發(fā)表時(shí)間： 2018.5.11       影響因子： 8.496

研究背景：

微生物群落通過影響營養(yǎng)和免疫功能在嬰兒發(fā)育早期起著重要作用，由于影響早期腸道微生物群組成的因素具有顯著的預(yù)后和治療意義，因此對(duì)于胎兒環(huán)境中微生物是否發(fā)生相互作用人們有著強(qiáng)烈的興趣，如果是這樣，那它們又是怎樣影響母嬰健康的？羊水歷來被視為是無菌部位，在健康妊娠中，中期妊娠羊水培養(yǎng)基研究發(fā)現(xiàn)羊水是無菌的，或僅在13%的羊水樣品中分離出細(xì)菌。然而，在妊娠并發(fā)癥（例如早產(chǎn)、先兆子癇、小于胎齡、胎膜早破）羊水中可檢測(cè)到細(xì)菌。最近使用二代測(cè)序在15個(gè)健康足月妊娠羊水樣本中檢測(cè)到的細(xì)菌序列，這表明羊水中含有微生物群落。健康足月羊水中檢測(cè)到微生物種群意味著新生兒出生前微生物定植，以及微生物對(duì)嬰兒健康發(fā)育的影響，在出生前就已經(jīng)開始了。

同樣，關(guān)于在子宮內(nèi)環(huán)境的其它組分中是否存在細(xì)菌種群也有爭(zhēng)論，包括胎盤、臍帶血和胎糞。目前細(xì)菌從21-26%健康足月分娩的胎盤中已被分離培養(yǎng)出來，另外從健康新生兒臍血中也分離出活菌（腸球菌、鏈球菌、葡萄球菌或丙酸桿菌）。隨著二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，細(xì)菌序列也從足月妊娠的胎盤和胎糞中被檢測(cè)到。然而，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，足月胎盤的細(xì)菌菌群類似于污染和實(shí)驗(yàn)對(duì)照的細(xì)菌菌群。此外，由于許多無菌動(dòng)物可以通過無菌剖宮產(chǎn)可靠地獲得，因此推斷健康妊娠的宮內(nèi)環(huán)境是無菌的。

人們對(duì)胎兒環(huán)境中的病毒也知之甚少，特定的致病性病毒如巨細(xì)胞病毒（CMV）、HIV、腸道病毒、流感、風(fēng)疹、水痘、寨卡和HPV肯定是通過胎盤或生殖道傳播給胎兒的。通過靶向PCR、CMV、腺病毒、單純皰疹病毒、人皰疹病毒6、腸道病毒、EB病毒、呼吸道合胞病毒和人細(xì)小病毒B19，可以在羊膜穿刺遺傳篩查獲得的羊水中鑒定到。此外，早產(chǎn)兒的早期大便檢測(cè)到既有真核病毒也有噬菌體。然而，沒有研究使用無偏的方法來確定羊水中是否存在病毒。

在這里，我們使用基于序列的方法檢測(cè)足月妊娠羊水中是否存在細(xì)菌群落或病毒群落（真核病毒和噬菌體），這將對(duì)我們了解嬰兒腸道最初是如何被微生物感染有重要的影響。

研究設(shè)計(jì)：

• qPCR檢測(cè)16S rRNA基因拷貝數(shù)：24例無并發(fā)癥足月妊娠的羊水標(biāo)本， 檢測(cè)羊水中的細(xì)菌生物量。
• 16S擴(kuò)增子測(cè)序（V4區(qū)）：羊水、水（試劑陰性對(duì)照）、緩沖液（提取陰性對(duì)照）和兒科糞便樣品（陽性對(duì)照），檢測(cè)羊水與對(duì)照組的細(xì)菌特征差異以及只在羊水中特異存在的細(xì)菌。
• 多重置換擴(kuò)增(MDA)：羊水、水（試劑陰性對(duì)照）、緩沖液（提取陰性對(duì)照）和兒科糞便樣品（陽性對(duì)照），檢測(cè)羊水是否存在病毒以及只在羊水中特異存在的病毒。
• spike-in實(shí)驗(yàn)：羊水樣品中加入1.8×10⁷拷貝含有部分腺病毒六鄰體基因的質(zhì)粒，然后靶向PCR擴(kuò)增，為了評(píng)估羊水中病毒的缺乏是否是由于PCR抑制劑存在造成的。

研究結(jié)果：

羊水含有較低的細(xì)菌生物量

我們?cè)u(píng)估了在剖宮產(chǎn)中獲得的24例無并發(fā)癥足月妊娠的羊水標(biāo)本。產(chǎn)婦年齡中位數(shù)為28歲，出生時(shí)嬰兒體重中位數(shù)為3288 g。為了定量羊水樣本中的細(xì)菌生物量，使用qPCR檢測(cè)了16S rRNA基因拷貝數(shù)。羊水樣品中的16S rRNA基因拷貝數(shù)為944 copies/mL (SD 374)，與兒童糞便樣本16S rRNA基因拷貝數(shù)3.92 ×10⁸ copies/g (SD 3.84 ×10⁸ )相比，細(xì)菌生物量非常低（圖1）。因?yàn)閾?dān)心這些低密度序列是污染，因此在陰性對(duì)照（試劑陰性對(duì)照：DNA-free water；提取陰性對(duì)照：extraction buffer）中尋找16S rRNA基因拷貝，水陰性對(duì)照的平均16S rRNA基因拷貝數(shù)為93個(gè)拷貝/ml（SD 40），緩沖液提取陰性對(duì)照的平均16S rRNA基因拷貝數(shù)為1062個(gè)拷貝/ml（SD 390）。盡管羊水16S rRNA基因拷貝數(shù)高于水陰性對(duì)照組，羊水和緩沖液提取陰性對(duì)照組之間的16S rRNA基因拷貝數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)際上，與先前的研究一致，羊水的16S rRNA基因拷貝數(shù)與提取陰性對(duì)照沒有區(qū)別。

圖1 在羊水樣品、水（試劑陰性對(duì)照）、緩沖液（提取陰性對(duì)照）和兒科糞便樣品中16S rRNA基因拷貝絕對(duì)定量。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義通過Mann Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，**P≤0.01, ***P≤0.0001. ns, non-significant

羊水細(xì)菌特征與對(duì)照不可區(qū)分

接下來，我們考慮羊水中含有一組與實(shí)試劑對(duì)照不同的細(xì)菌。因此，我們對(duì)羊水、水（試劑陰性對(duì)照）、緩沖液（提取陰性對(duì)照）和兒科糞便樣品（陽性對(duì)照）進(jìn)行了16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序。我們發(fā)現(xiàn)羊水標(biāo)本的細(xì)菌豐富度和緩沖液提取陰性對(duì)照之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，羊水細(xì)菌豐富度高于水陰性對(duì)照組，但低于糞便對(duì)照組（圖2A）。為了比較羊水標(biāo)本和對(duì)照組之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了PCoA分析，羊水標(biāo)本與緩沖液提取陰性對(duì)照重疊，但不同于糞便（陽性對(duì)照）和水陰性對(duì)照（圖2B）。雖然與其它糞便樣品相比，糞便細(xì)菌菌群與緩沖液對(duì)照差異顯著（圖2C，右），但我們檢測(cè)到羊水細(xì)菌菌群和緩沖液對(duì)照之間沒有顯著差異（圖2C，左）。

圖2  A每個(gè)樣品類型的細(xì)菌豐富度（細(xì)菌OTUs數(shù)目）；B  PCoA分析；C樣本類型內(nèi)部或者樣本類型和緩沖液對(duì)照之間的Bray Curtis相異性分析。

接著我們?cè)噲D確定在羊水中存在，但是緩沖液和水陰性對(duì)照中不存在的細(xì)菌OTUs，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)只存在于羊水中的細(xì)菌OTUs占很少的相對(duì)豐度（圖2D）。重要的是，這些罕見的細(xì)菌OTUs沒有頻繁地在其他羊水標(biāo)本中檢測(cè)到。

圖2  D 只存在于羊水中的細(xì)菌OTUs相對(duì)豐度

羊水中很少檢測(cè)到病毒

新興的“羊膜內(nèi)微生物群”假說提出羊水也可能含有一個(gè)病毒群落。因此，我們調(diào)查了這些羊水標(biāo)本的病毒。為了全面檢測(cè)DNA和RNA病毒，從羊水樣品中提取的總核酸經(jīng)過與序列無關(guān)的DNA和RNA擴(kuò)增（SIA），同樣在這些實(shí)驗(yàn)中包括水陰性對(duì)照和緩沖提取陰性對(duì)照。只有一個(gè)羊水樣本檢測(cè)到了真核病毒--GB病毒C（10號(hào)標(biāo)本, 12條病毒測(cè)序序列）。因?yàn)槲覀冎昏b定了一個(gè)RNA病毒，然后我們使用多重置換擴(kuò)增(MDA)來檢測(cè)，這種方法僅識(shí)別DNA病毒，并且通常比SIA方法更敏感。羊水中平均病毒測(cè)序數(shù)為331個(gè)（SD 248），相比之下，糞便標(biāo)本平均獲得34027個(gè)病毒測(cè)序數(shù)（SD 44667）（圖3A）。羊水樣品的病毒豐度小于緩沖液提取陰性對(duì)照、水陰性對(duì)照和糞便樣品（圖3B）。羊水中檢測(cè)到的大多數(shù)病毒可歸因于提取陰性對(duì)照和/或水陰性對(duì)照（圖3C）。

圖3  A 不同樣本類型的病毒測(cè)序序列數(shù)目；B不同樣本類型的病毒豐富度；C 分配給不同樣本類型的不同病毒種類的熱圖。

接下來我們?cè)噲D確定僅在羊水標(biāo)本中，但不存在于對(duì)照組的病毒。我們發(fā)現(xiàn)，一個(gè)羊水標(biāo)本（標(biāo)本5）有一個(gè)噬菌體的106條測(cè)序序列，這個(gè)噬菌體最類似于氣單胞菌噬菌體44 RR2.8T。然而，大多數(shù)其它羊水標(biāo)本沒有“羊水特異存在的”病毒序列（圖3D）。

圖3  D只存在于羊水中的病毒豐度

為了評(píng)估PCR抑制劑是否可能存在于羊水標(biāo)本中，我們進(jìn)行了一項(xiàng)spike-in實(shí)驗(yàn)。在羊水樣品中加入1.8×10⁷拷貝含有部分腺病毒六鄰體基因的質(zhì)粒，然后進(jìn)行總核酸提取。定量PCR檢測(cè)靶向核酸，檢測(cè)到3.3×10⁶拷貝（圖3E），表明羊水中病毒的缺乏不是由于PCR抑制劑造成的。

圖3  E羊水樣品和spike-in樣品（點(diǎn)線）中的腺病毒質(zhì)粒數(shù)量

研究結(jié)論：

我們用二代測(cè)序方法對(duì)24例無并發(fā)癥的足月妊娠羊水進(jìn)行了病毒和細(xì)菌進(jìn)行了鑒定。與預(yù)期相反，羊水中的細(xì)菌菌群與陰性對(duì)照是無法區(qū)分的。羊水中病毒的序列很少，沒有發(fā)現(xiàn)樣本間存在有共有核心病毒的證據(jù)。