腫瘤組織和cfDNA外顯子組捕獲測序 標準服務(wù)說明

發(fā)稿時間：2018-05-09來源：天昊生物

1. 服務(wù)介紹

腫瘤因體細胞突變（Somatic Mutation）積累引起。相較于常規(guī)樣本中生殖突變（Germline Mutation）位點的檢測，腫瘤樣本因為純度低、異質(zhì)性高、突變頻率低等原因，需要更高的測序深度、更優(yōu)化的數(shù)據(jù)分析方法才能更有效精確地鑒定其中的突變位點。

全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing，WES），作為大規(guī)模組學研究的常備技術(shù)，是一種利用雜交技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕獲富集后進行高通量測序，從而鑒定并發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能變異相關(guān)突變的技術(shù)手段。相較于全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS），全外顯子組測序更加經(jīng)濟、高效，在相同測序成本條件下，可以高深度地檢測更多的實驗樣品，更為精準地鑒定常見變異以及罕見變異，高效發(fā)現(xiàn)全新突變。

天昊生物使用全自動核酸抽提工作站，確保樣本抽提的穩(wěn)定性，最大程度避免樣本間污染；使用業(yè)內(nèi)最優(yōu)的Covaris超聲基因組片段化方案，結(jié)合精心優(yōu)化的文庫構(gòu)建體系進行DNA文庫構(gòu)建，最大程度地保證文庫轉(zhuǎn)化效率，在滿足高深度測序的同時，盡可能減少珍貴實驗樣本的消耗；高口碑的Agilent SureSelect Human All Exon V6芯片，捕獲效率優(yōu)，目標區(qū)域覆蓋均勻度高；多重保障確保腫瘤樣本體細胞突變檢出的靈敏度和特異性。

2. 技術(shù)優(yōu)勢

•   金標準：使用業(yè)界公認的Agilent SureSelect Human All Exon V6芯片。
• 一代驗證：免費使用SNPscan?技術(shù)確保樣本中高頻突變檢出的準確性。
•  高性價比：相較全基因組測序，相同測序量可高深度地檢測更多實驗樣品。

3. 應(yīng)用領(lǐng)域

多個癌種的組織或cfDNA全外顯子捕獲測序

4. 技術(shù)路線圖

 

5. 技術(shù)參數(shù)及分析內(nèi)容

 

6. 案例分析

案例1：EGFR突變的晚期肺癌患者中共現(xiàn)的遺傳變異對進化和臨床的影響

Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers

期刊：Nature Genetics

發(fā)表時間：2017年11月

影響因子：27.959

第一單位：Department of Medicine, University of California, USA

 

背景簡介：關(guān)于癌癥遺傳學和治療當前主要關(guān)注某一種致癌基因呈陽性的疾病，例如非小細胞肺癌中EGFR突變，但是這種方法并沒有解決癌癥中一些共現(xiàn)的遺傳變異的潛在風險。那么這些共現(xiàn)的遺傳變異究竟能達到怎樣的程度，與主要的驅(qū)動基因（如EGFR）共同促進腫瘤發(fā)展和治療抗性？本研究就提出這樣的假設(shè)：共現(xiàn)的遺傳變異普遍存在，而且與主要的驅(qū)動基因組成共驅(qū)動基因（co-drivers），從而促進腫瘤進展并且限制靶向治療的效果。

 

研究方法：收集1122例EGFR突變陽性和1008例突變陰性的晚期肺癌患者的全血樣本，對其中游離的DNA（cfDNA）進行68個臨床相關(guān)的基因的外顯子進行測序分析。并且對一例EGFR突變肺癌患者的7份縱向收集的樣本進行全外顯子測序。

 

主要結(jié)果：

1.晚期EGFR突變肺癌患者cfDNA分析：首先在EGFR突變陽性和陰性組之間發(fā)現(xiàn)了部分共現(xiàn)的突變基因，而且有顯著差異（圖1）。而且在440例EGFR p.Thr790Met突變陽性和682例突變陰性之間也發(fā)現(xiàn)了差異性的共現(xiàn)變異（圖2）。

2.EGFR突變患者cfDNA與臨床結(jié)果：對不同時期的TKI治療患者的cfDNA進行分析發(fā)現(xiàn)了治療能夠誘導(dǎo)基因組共現(xiàn)變異的進化（圖3）。

3.基因組縱向時空的表征分析：伴隨TKI治療和抗性的進展，在診斷期患者超過75%的編碼區(qū)突變呈克隆級別，但在死亡時下降到50%-58%，同時出現(xiàn)了亞克隆的突變（圖4）。

 

研究結(jié)論：

本研究強調(diào)了開展更多知情的及基因上授權(quán)的，包括分子診斷、監(jiān)測及動態(tài)應(yīng)用多種理性的治療策略的重要性，來處理克隆和亞克隆的共現(xiàn)變異，從而更好地控制癌癥。而且本研究所揭示的內(nèi)容有助于改變當前關(guān)于對癌基因呈陽性肺癌的認識，也為基礎(chǔ)和臨床研究提供了未來的方向。

 

圖1 晚期EGFR突變陽性與陰性肺癌患者間cfDNA共現(xiàn)的基因組變異 

 

圖2 440例EGFRp.Thr790Met突變陽性和682例突變陰性晚期NSCLC患者共現(xiàn)的基因組變異比較

圖3 EGFR突變晚期NSCLC患者cfDNA中檢測到隨治療誘導(dǎo)的基因組共現(xiàn)變異的進化

 

圖4 一例EGFR突變患者從診斷到死亡期間腫瘤及cfDNA縱向基因組分析

 

[1] Blakely CM, Watkins TBK, Wu W, Gini B, Chabon JJ, et al. (2017) Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers. Nat Genet 49: 1693-1704. DOI: 10.1038/ng.3990.

 

案例2：追蹤非小細胞肺癌的進化發(fā)展

Tracking the evolution of non-small cell lung cancer

期刊：The New England Journal of Medicine

發(fā)表時間：2017年6月

影響因子：72.406

第一單位：The Cancer Research UK Lung Cancer Centre of Excellence

 

背景簡介：英國癌癥研究中心（Cancer Research UK）自2014年4月開始資助招募患者,通過治療來追蹤非小細胞肺癌的進化發(fā)展，這是一項多個中心協(xié)調(diào)進行的前瞻性群組研究，預(yù)期收集842例肺癌患者腫瘤組織樣本進行高深度、多區(qū)域的全外顯子測序，其目的是為了驗證瘤內(nèi)異質(zhì)性（突變、拷貝數(shù)變異）與臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)這一假設(shè)。本文對首先收集的100例患者樣本進行分析。

 

研究方法：利用Illumina Hiseq技術(shù)對327個腫瘤區(qū)域（100例患者）及100例對應(yīng)的全血germline樣本進行全外顯子測序，測序深度達到426×。

 

主要結(jié)果：

1.非小細胞肺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性：30%的體細胞突變（中位數(shù)）及48%的拷貝數(shù)變異（中位數(shù)）分別被識別為亞克隆，表明在腫瘤的發(fā)展中突變和染色體水平上的基因組不穩(wěn)定性過程一直在發(fā)生（圖1A）。另外亞克隆拷貝數(shù)變異比例較高的患者其復(fù)發(fā)或死亡風險顯著更高（P = 4.4×10^?4，圖1C），而亞克隆突變的比例與腫瘤復(fù)發(fā)并無顯著的相關(guān)性（P = 0.70，圖1B）。

2.非小細胞肺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性的影響因素包括突變過程、染色體不穩(wěn)定性及基因組加倍。

3.克隆或亞克隆驅(qū)動基因的改變與基因組事件的發(fā)生時間：特定癌癥的基因改變主要是在克隆水平，而且在基因組復(fù)制前就會發(fā)生，這表明這些改變參與了癌癥的起始（圖2）。以腺癌為例，這些改變包括EGFR/MET/BRAF靶向的突變或擴增，TERT基因8p缺失及5p增加等。

 

研究結(jié)論：

通過對早期非小細胞肺癌驅(qū)動事件與克隆性之間的關(guān)系進行研究，能夠發(fā)現(xiàn)基因組不穩(wěn)定性不僅是平行進化的重要驅(qū)動因素，而且預(yù)示了較差的預(yù)后。

 

 

圖1 非小細胞肺癌患者腫瘤組織的基因組異質(zhì)性

 

圖2 體細胞事件在非小細胞肺癌進化中的時間進程

 

[2] Jamal-Hanjani M, Wilson GA, McGranahan N, Birkbak NJ, Watkins TBK, et al. (2017) Tracking the Evolution of Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med 376: 2109-2121. DOI: 10.1056/NEJMoa1616288.