天昊目的區(qū)域甲基化MethylTarget?檢測(cè)技術(shù)動(dòng)物領(lǐng)域再發(fā)新文

發(fā)稿時(shí)間：2018-04-12來(lái)源：天昊生物

繼天昊MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測(cè)序技術(shù)動(dòng)物領(lǐng)域首發(fā)文章后，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物健康與食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室利用MethylTarget^?技術(shù)近期又在《Comparative Biochemistry and Physiology》雜志上發(fā)表了母雞補(bǔ)充甜菜堿通過(guò)DNA甲基化修飾來(lái)調(diào)控F1代公雞下丘腦膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)的文章。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們?cè)俑蠹曳窒硪幌挛恼碌难芯克悸贰?

英文題目：Dietary betaine supplementation in hens modulates hypothalamic expression of cholesterol metabolic genes in F1 cockerels through modification of DNA methylation

中文題目：母雞補(bǔ)充甜菜堿可以通過(guò)DNA甲基化修飾來(lái)調(diào)控F1代公雞下丘腦膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)

期刊名：Comparative Biochemistry and Physiology, Part B     影響因子： 1.757

技術(shù)：MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測(cè)序技術(shù)

實(shí)驗(yàn)描述如皋黃羽蛋雞隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料組和補(bǔ)充甜菜堿(0.5%)喂養(yǎng)組，喂養(yǎng)30天后，收集雞蛋進(jìn)行孵化，孵化的小雞相同條件下生長(zhǎng)56天，然后進(jìn)行稱重和取樣。取頸靜脈至肝素抗凝管，3000×g離心，4°C 10分鐘制備血漿。解剖下丘腦，迅速在液氮中冷凍，然后儲(chǔ)存在?70°C作進(jìn)一步分析。

研究目的: 

甜菜堿廣泛應(yīng)用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)，作為蛋氨酸代謝中的甲基供體可通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)重編程。目前不清楚蛋雞喂養(yǎng)添加甜菜堿的飲食是否會(huì)影響F1代下丘腦的膽固醇代謝。

研究結(jié)果：

血漿和下丘腦膽固醇含量

母雞補(bǔ)充甜菜堿并沒(méi)有改變體重，但是F1公雞血漿總膽固醇和高密度脂蛋白（HDL-C）濃度顯著增加，此外，母雞喂養(yǎng)甜菜堿可顯著增加F1公雞下丘腦總膽固醇和膽固醇酯含量（表3）。

表2  體重；血漿中總膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量；下丘腦中總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯含量。Tch：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白；BW, 體重； Free Cho：游離膽固醇；Cho Ester：膽固醇酯。

下丘腦膽固醇代謝基因的表達(dá)

母體喂養(yǎng)甜菜堿顯著上調(diào)下丘腦SREBP1, SREBP2, LDLR 轉(zhuǎn)錄水平（圖1A）和蛋白水平（圖1B）。在甜菜堿組HMGCR mRNA水平增加，而CYP46A1 mRNA水平下降。此外，在甜菜堿組ACAT1和APO-A1 mRNA水平均明顯升高。

圖1 母體補(bǔ)充甜菜堿對(duì)F1代下丘腦膽固醇代謝基因表達(dá)的影響。A.下丘腦中SREBP1, SREBP2, HMGCR, CYP46A1, ACAT1, APO-A, LDLR mRNA水平。B. SREBP1, SREBP2, LDLR蛋白水平。

下丘腦甲基轉(zhuǎn)移和神經(jīng)肽相關(guān)基因的表達(dá)

母體喂養(yǎng)甜菜堿可在轉(zhuǎn)錄（圖2A）和蛋白水平（圖2B）上使BHMT和DNMT1表達(dá)明顯增加。此外，與對(duì)照組相比，甜菜堿組中下丘腦BDNF和CRH mRNA水平表達(dá)顯著下調(diào)，而NPY mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（圖2C）。

圖2  補(bǔ)充甜菜堿對(duì)F1代下丘腦甲基轉(zhuǎn)移和神經(jīng)肽相關(guān)基因表達(dá)的影響。A.下丘腦BHMT, DNMT1,DNMT3A mRNA表達(dá)水平。B. 下丘腦BHMT, DNMT1,DNMT3A 蛋白表達(dá)水平。C. BDNF, NPY, CRH mRNA表達(dá)水平。

下丘腦SREBP1, SREBP2, APO-A1等基因啟動(dòng)子CpG甲基化

對(duì)下丘腦基因組DNA進(jìn)行了MethylTarget^?技術(shù)分析（mean coverage of> 600×），結(jié)果發(fā)現(xiàn)SREBP1, SREBP2, APO-A1等基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)受母體喂養(yǎng)甜菜堿調(diào)節(jié)。SREBP1(?1350 to ?1199), SREBP2 (?2030 to ?1612), APO-A1 (?725 to ?505)等基因的近端啟動(dòng)子區(qū)被用于甲基化分析（圖3）。SREBP1啟動(dòng)子區(qū)段包括包含11個(gè)CpG位點(diǎn)，這些CpG位點(diǎn)在甜菜堿組相對(duì)于對(duì)照組都是低甲基化。SREBP2啟動(dòng)子區(qū)段包括包含4個(gè)CpG位點(diǎn)，其中3個(gè)CpG位點(diǎn)在甜菜堿組相對(duì)于對(duì)照組是低甲基化的， 另外1個(gè)CpG位點(diǎn)則是在甜菜堿組高甲基化。APO-A1啟動(dòng)子區(qū)段包括包含5個(gè)CpG位點(diǎn)，這些CpG位點(diǎn)在甜菜堿組相對(duì)于對(duì)照組都是低甲基化?？偟膩?lái)說(shuō)，SREBP1, SREBP2, APO-A1所檢測(cè)的3個(gè)片段平均甲基化程度在甜菜堿組明顯降低，這與它們的mRNA豐度呈負(fù)相關(guān)。

圖3  F1代下丘腦SREBP1,SREBP2,APO-A1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。 SREBP1 (?1350–?1199), SREBP2 (?2030–?1612)和APO-A1 (?727–?505) 5’側(cè)翼啟動(dòng)子序列示意圖。SREBP1, SREBP2, 和APO-A1 啟動(dòng)子區(qū)域平均甲基化狀態(tài)（左圖）和差異甲基化CpG位點(diǎn)（右圖）。

總結(jié)：◆

•  甜菜堿組血漿總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇含量顯著升高，下丘腦中總膽固醇和膽固醇酯含量也顯著升高。
• 相應(yīng)的，下丘腦SREBP2, HMGCR, LDLR, SREBP1, ACAT1，APO-A1等基因表達(dá)顯著上調(diào)，CYP46A1表達(dá)上調(diào)，這些變化與BDNF和CRH表達(dá)顯著下調(diào)以及NPY表達(dá)顯著上調(diào)有關(guān)。
• 此外，參與甲基轉(zhuǎn)移循環(huán)的基因也被調(diào)控，例如DNMT1和BHMT的mRNA和蛋白水平都顯著上調(diào)，這與SREBP-1, SREBP-2，APO-A1等基因的啟動(dòng)子CpG甲基化明顯修飾相關(guān)。
• 這些結(jié)果表明，蛋雞喂養(yǎng)甜菜堿可以通過(guò)啟動(dòng)子DNA甲基化修飾來(lái)調(diào)控F1代公雞下丘中參與膽固醇代謝和腦功能相關(guān)基因的表達(dá)。

天昊創(chuàng)新性MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測(cè)序技術(shù)：

• 性價(jià)比高：傳統(tǒng)克隆測(cè)序一個(gè)片段10個(gè)克隆的價(jià)格，MethylTarget可以完成約60個(gè)片段的檢測(cè)（檢測(cè)深度為1000X，相當(dāng)于1000個(gè)克隆）
• 精確度高：基于二代測(cè)序數(shù)據(jù)檢測(cè)甲基化程度，精確到單堿基分辨率，與基于測(cè)序的全基因組甲基化測(cè)序，RRBS數(shù)據(jù)有高度一致性
• 精確定量：測(cè)序深度高達(dá)1000X，并可以進(jìn)一步加深，相比于傳統(tǒng)克隆測(cè)序，可以對(duì)位點(diǎn)甲基化程度進(jìn)行準(zhǔn)確定量
• 技術(shù)靈活：基于多重PCR富集進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域富集，可隨時(shí)進(jìn)行基因和位點(diǎn)的變化和改動(dòng)，并且可以獲得每個(gè)片段的甲基化單倍型