靶向捕獲測序在進(jìn)化及生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

發(fā)稿時(shí)間：2018-03-15來源：天昊生物

靶向捕獲測序在進(jìn)化及生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，已經(jīng)成功解決了一些數(shù)年前難以想象的生物學(xué)問題。靶向捕獲測序是對感興趣的基因組區(qū)域預(yù)先擴(kuò)增和富集，然后進(jìn)行建庫測序的一種技術(shù)策略，可以通過基于PCR的捕獲或者基于固相和液相捕獲探針組等方法實(shí)現(xiàn)。鑒于該策略在技術(shù)上的優(yōu)點(diǎn)和可行性，靶向捕獲測序在生物進(jìn)化和生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛。

雖然目前測序成本不斷降低，測序通量逐漸增大，但是由于不同物種基因組大小和復(fù)雜性的不同，靶向捕獲測序在某些物種基因組學(xué)及功能研究中仍是最優(yōu)策略。以高比例重復(fù)序列為特征的大基因組(例如火炬松基因組22 Gb，重復(fù)序列約占83%)，這些重復(fù)序列會對我們關(guān)心目標(biāo)區(qū)域造成干擾，需要靶向捕獲來優(yōu)選以避免這些重復(fù)區(qū)域，聚焦基因組序列中的目標(biāo)功能區(qū)域。為此，靶向捕獲廣泛應(yīng)用于具有多倍體基因組和轉(zhuǎn)座子豐度物種的蛋白質(zhì)編碼變異檢測，完成全基因組測序無法解決的物種基因組研究。

靶向捕獲主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)編碼外顯子區(qū)域，但是對于調(diào)節(jié)區(qū)域如UTR、miRNA、啟動子區(qū)域和其它非編碼元件，只要序列GC含量適中，同樣可以進(jìn)行。此外，還可以利用目標(biāo)基因位點(diǎn)的覆蓋均勻性來基于相對覆蓋度推斷拷貝數(shù)變化。在這方面使用靶向捕獲是一個(gè)巨大的優(yōu)勢，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)變異(例如全基因組或基因復(fù)制和染色體重排)可以在適應(yīng)和物種形成中發(fā)揮重要作用。當(dāng)然，由于文庫制備或雜交過程中引入的偏差可能導(dǎo)致CNV的不準(zhǔn)確，需要在后期根據(jù)實(shí)際情況予以校正。

無參考基因組的靶向捕獲測序

靶向捕獲方法的實(shí)施需要以目標(biāo)基因區(qū)段的序列已知為前提。因此，首要問題是獲得用于捕獲探針設(shè)計(jì)的目標(biāo)基因區(qū)段序列。對于有參基因組的物種來說，數(shù)據(jù)庫信息相對完備，靶向捕獲的探針設(shè)計(jì)、文庫制備以及生物信息學(xué)會容易很多，這里就不展開討論了。

對于生物進(jìn)化及生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中涉及的無參考基因組的物種還有很多。于是，人們針對無參考基因組或非模式物種，通過de novo測序組裝策略來獲得靶向捕獲需要的序列信息，這些方法理論上可以應(yīng)用于任何物種。例如，可以使用de novo RNA-seq或表達(dá)序列標(biāo)簽( EST )數(shù)據(jù)來設(shè)計(jì)對應(yīng)于外顯子區(qū)域的探針。這里存在的一個(gè)技術(shù)挑戰(zhàn)在于對外顯子邊界的識別，因?yàn)榭缭酵怙@子邊界的探針捕獲將造成目標(biāo)區(qū)域的低覆蓋度和較低的總體捕獲性能。外顯子邊界往往是保守的，并且通?？梢酝ㄟ^與其它不同物種參考基因組的注釋比較來識別。此外，也可以對低覆蓋度全基因組測序（LC-WGS）測序序列進(jìn)行de novo組裝，然后根據(jù)目標(biāo)區(qū)域序列設(shè)計(jì)探針進(jìn)行靶向捕獲。LC-WGS數(shù)據(jù)也可以與近緣物種參考基因組比對，識別用于捕獲的保守外顯子區(qū)域。

基于de novo組裝的靶向捕獲方法為了降低成本，通常需要進(jìn)行兩次測序?qū)嶒?yàn)，首先是針對有代表性的小量樣本的測序。例如，RNA-seq可以來自單個(gè)個(gè)體，然后進(jìn)行后期的進(jìn)化和生態(tài)規(guī)模大樣本的靶向捕獲測序。

何時(shí)采用靶向捕獲測序？

目前沒有一個(gè)放之四海而皆準(zhǔn)的測序策略能夠解決所有生物學(xué)問題，需要根據(jù)具體的研究內(nèi)容及目標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。靶向捕獲測序可以應(yīng)用于生物進(jìn)化和生態(tài)研究的幾個(gè)活躍領(lǐng)域包括：

• 表型性狀的遺傳作圖

遺傳作圖仍然是鑒定表型進(jìn)化的遺傳機(jī)制的主要方法之一。通過雜交或關(guān)聯(lián)研究的QTL作圖需要有遺傳圖譜信息。然而，作圖研究很少可以達(dá)到單個(gè)基因或標(biāo)記分辨率。在這些情況下，靶向捕獲測序可用于將未知遺傳變異信息錨定到已知基因或其它功能元件上，從而真正尋找到關(guān)鍵變異位點(diǎn)。

• 檢測基因組中的選擇

自然選擇是控制進(jìn)化變化的重要方面?；蚪M測序技術(shù)可以讓人們了解不同生物體基因組中選擇頻率、模式和分布情況。然而目前評估大規(guī)模選擇模式所需的數(shù)據(jù)主要來自于參考基因組完備的類群。因此為了加深我們對形成遺傳多樣性的進(jìn)化過程的理解，需要將這些研究擴(kuò)展到不同的自然群體。對目標(biāo)外顯子、側(cè)翼內(nèi)含子、上下游調(diào)控序列的長連續(xù)區(qū)域或甚至非編碼基因間區(qū)域上的大片區(qū)域的檢測，可以提供強(qiáng)大的選擇性掃描，估計(jì)選擇性掃描強(qiáng)度和基因組變化速率的能力。

• 系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究

靶向捕獲測序的靈活性為系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究提供了巨大的優(yōu)勢技術(shù)。定制的捕獲設(shè)計(jì)可以針對數(shù)百或數(shù)千個(gè)位點(diǎn)，以解決一系列系統(tǒng)發(fā)育問題。為了最大化系統(tǒng)發(fā)育信息，選擇進(jìn)化速率適合于解決給定關(guān)系的基因座非常重要。例如，深層系統(tǒng)發(fā)育節(jié)點(diǎn)是通過進(jìn)化緩慢的序列來解析的，這些序列在遙遠(yuǎn)的分類群中保留了正交信號?；诤喕蚪M方法得到的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育推斷，其大部分低于屬水平。靶向捕獲測序能夠捕獲緩慢進(jìn)化的超保守元件標(biāo)記物，已成為解決脊椎動物系統(tǒng)發(fā)育中深層節(jié)點(diǎn)的一種非常有前景的方法。此外，靶向捕獲測序可以來解決群體遺傳的有效性問題，例如有效群體大小、基因流動、系統(tǒng)地理學(xué)等。

• 古代DNA與宏基因組學(xué)的應(yīng)用

從古生物遺骸、沉積物和博物館標(biāo)本中提取的古代或歷史DNA (aDNA )可以提供對譜系進(jìn)化歷史的證據(jù)。處理古生物學(xué)樣品中的aDNA樣品的一個(gè)挑戰(zhàn)是從細(xì)菌DNA和靶DNA的復(fù)雜混合物中分離感興趣的序列。例如，約55000年的人骨碎片的殘余物中約99 %的污染環(huán)境DNA組成。通過設(shè)計(jì)捕獲特定靶序列的探針，可以大大減少了大量污染物DNA測序的問題。目前，從環(huán)境樣品中分離和測序DNA(宏基因組學(xué))以研究病原體進(jìn)化或微生物群落組成也是一個(gè)熱門領(lǐng)域。此外，靶向捕獲可以提供高通量的方法來對物種條形碼進(jìn)行檢測，分析群落組成，探索群落中的功能變化，例如靶向檢測特定生態(tài)功能下的基因等。

參考文獻(xiàn)

1. Targeted capture in evolutionary and ecological genomics. Molecular Ecology, 2016

2. From genomes to GENE-omes exome sequencing concept and applications in crop Improvement. Frontiers in Plant Science, 2017

關(guān)于天昊

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