【昊閱讀】花生種子性狀SSR分子標(biāo)記關(guān)聯(lián)研究

發(fā)稿時(shí)間：2018-02-06來(lái)源：天昊生物

文章題目：Genetic Variation and Association Mapping of Seed-Related Traits in Cultivated Peanut (Arachis hypogaea L.) Using Single-Locus Simple Sequence Repeat Markers

利用單位點(diǎn)簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）進(jìn)行栽培種花生遺傳變異與種子相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)分析

發(fā)表期刊：Frontiers in Plant Science 發(fā)表時(shí)間：2017-12-11 影響因子：4.3

 

摘要一覽：

花生是世界重要的食用油和可消化蛋白質(zhì)來(lái)源，其栽培種（Arachis hypogaea L.）是一種異源四倍體（AABB，2n = 4x = 40），它的種子大小和重量是顯著影響花生產(chǎn)量與營(yíng)養(yǎng)成分的重要農(nóng)藝性狀。然而目前對(duì)種子相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)仍然模糊不清。關(guān)聯(lián)作圖是快速有效地探索植物重要性狀遺傳基礎(chǔ)的有力途徑。在這項(xiàng)研究中，研究人員利用554個(gè)單位點(diǎn)SSR分子標(biāo)記，對(duì)104個(gè)花生品種的種子相關(guān)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究。大部分花生品種在檢測(cè)組合中與SSR標(biāo)記沒(méi)有或弱相關(guān)，連鎖不平衡的衰減在基因組水平大約為1cM的遺傳距離，并且B亞組的LD衰減比A亞組要快。在關(guān)聯(lián)分析中四個(gè)與種子相關(guān)性狀觀察到了很大的表型變異。針對(duì)人口結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系采用混合線性模型，檢測(cè)到不同環(huán)境中與4個(gè)種子性狀顯著相關(guān)的30個(gè)SSR標(biāo)記（P＜1.81x10^-3），解釋了各種性狀表型變異的11.22-32.30%，其中AHGA44686標(biāo)記可以解釋多種環(huán)境下的大量表型變異（26.23-32.30%）。與種子性狀相關(guān)有利等位基因的關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記，以及相關(guān)標(biāo)記等位基因最佳組合的確定，顯著提高了性狀表現(xiàn)，揭示了這些關(guān)聯(lián)標(biāo)記在花生育種中的應(yīng)用潛力。

 

實(shí)驗(yàn)材料：

中國(guó)花生99份核心種質(zhì)和附加的五份品種（Zhonghua 6_vul、Zhonghua 10_vul、Yuanza 9102_vul、ICG6375_vul和ICG12625_aeq）。

 

研究方法：

1、SSR分子標(biāo)記多態(tài)性及基因分型檢測(cè)

新鮮葉片提取DNA，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行質(zhì)檢。匯總公開(kāi)發(fā)表文獻(xiàn)中的4485個(gè)SSR標(biāo)記，對(duì)表型變異豐富的十個(gè)品種進(jìn)行標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)。隨后，對(duì)單位點(diǎn)模式分離的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行毛細(xì)管電泳篩選，利用GeneMarker軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后用于104個(gè)品種的基因型關(guān)聯(lián)檢測(cè)。雜合子基因型作為缺失數(shù)據(jù)處理，罕見(jiàn)等位基因型SSR的次要等位基因頻率（MAF）不大于0.05，對(duì)于部分無(wú)法歸類的將舍棄處理以此增加關(guān)聯(lián)分析的效能。分子標(biāo)記PIC和基因多樣性利用PowerMarker軟件計(jì)算獲得。

2、群體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析

群體結(jié)構(gòu)（Q矩陣）的評(píng)估是利用STRUCTURE軟件，基于SSR分子標(biāo)記多態(tài)性進(jìn)行的。STRUCTURE是一種基于模型的聚類方法，利用多位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)推斷種群結(jié)構(gòu)并將個(gè)體分配給群體。應(yīng)用獨(dú)立等位基因頻率的混合模型從1到10估計(jì)每一個(gè)可能的群（K）。為了得到可靠的亞群，其他參數(shù)設(shè)置為一個(gè)更高的標(biāo)準(zhǔn)，例如老化長(zhǎng)度測(cè)試以100000次迭代，每個(gè)K跑五次。為了獲得最佳K值，一種通過(guò)K值間的LnP(D)變化速率來(lái)計(jì)算（ΔK）的方法被廣泛應(yīng)用。如果計(jì)算品種的同類可能性 ≥ 0.70則被劃為一組，否則將歸類到混合組中。Nei’s遺傳距離是根據(jù)PowerMarker軟件的無(wú)根鄰接樹計(jì)算獲得。親緣關(guān)系系數(shù)估計(jì)矩陣?yán)?/span>SPAGeDi軟件包進(jìn)行計(jì)算。

3、連鎖不平衡分析

一般來(lái)說(shuō)，相關(guān)系數(shù)r²是用來(lái)評(píng)估LD的，常使用的軟件如TASSEL。r²顯著性分析是通過(guò)Fisher檢驗(yàn)計(jì)算的，這些SSR標(biāo)記通過(guò)定位到花生的高密度遺傳連鎖圖譜上來(lái)評(píng)估其LD水平。位于同一連鎖群標(biāo)記對(duì)被視為連鎖的標(biāo)記，否則為不連鎖標(biāo)記。LD背景定義為95%不連鎖標(biāo)記的r²分布，這被視為判斷LD是否為遺傳連鎖的群體特定閾值。遺傳距離的LD衰減是通過(guò)區(qū)間間隔而非對(duì)應(yīng)各個(gè)標(biāo)記來(lái)估計(jì)，基于標(biāo)記間距離將r²值分為0–0.5、0.5–1、1–2、2–5、5–10、10–15、15–20、20–25、25–50、50–75、75–100和100–150 cM的距離，然后利用非線性回歸函數(shù)對(duì)LD衰減進(jìn)行擬合。LD衰減不僅對(duì)整個(gè)基因組，而且在A和B亞組水平進(jìn)行。

4、全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用TASSEL軟件的簡(jiǎn)化混合線性模型（cMLM）來(lái)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，通過(guò)同時(shí)根據(jù)群體結(jié)構(gòu)（Q矩陣）和相對(duì)親緣關(guān)系（K矩陣）來(lái)限制分散關(guān)聯(lián)。在這項(xiàng)研究中，人們使用調(diào)整后的Bonferroni法對(duì)關(guān)聯(lián)分析進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，其中P值閾值為1.81 x 10^-3。

 

研究結(jié)果

1、花生種群結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系檢測(cè)

在4485個(gè)SSR標(biāo)記中，共有554個(gè)SSR標(biāo)記呈現(xiàn)單點(diǎn)模型的多態(tài)性分離。利用這554個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估。最顯著的LnP(D)變化出現(xiàn)在K從2到3時(shí)，峰值出現(xiàn)在K為3時(shí)（圖1）。根據(jù)分組概率分析，所有品種可劃分到三個(gè)類群或混合群中的任何一個(gè)。Pop1組共有40種（37.70%），其中27種（67.50%）屬于ssp. hypogaea。29種被分到Pop2組，其中96.60%屬于ssp. fastigiata。第三組POP 3包括12種，混合組中有8個(gè)（34.80%個(gè)）和15個(gè)（65.20%個(gè)）分別加入到ssp. hypogaea和ssp. fastigiata中。聚類劃分基于Nei’s遺傳距離（圖2）。

 

圖1、花生檢測(cè)的群體結(jié)構(gòu)。

（A）兩種方法確定最佳的K值。（B）在K=3情況下計(jì)算的群體結(jié)構(gòu)

 

圖2、基于SSR基因分型數(shù)據(jù)的樹狀圖

群體相對(duì)親緣關(guān)系是通過(guò)對(duì)554個(gè)單點(diǎn)SSR標(biāo)記檢測(cè)進(jìn)行評(píng)價(jià)的。平均相對(duì)親緣關(guān)系值為0.11。超過(guò)70%的成對(duì)親緣估計(jì)值低于0.05，在較高的親緣關(guān)系評(píng)估類別中，親緣值下降頻率不斷降低，表明這些種質(zhì)之間沒(méi)有或有非常弱的遺傳關(guān)系（圖3）。

 

圖3、相對(duì)親緣關(guān)系估計(jì)分布圖

2、花生基因組LD衰減分析

花生關(guān)聯(lián)LD程度通過(guò)定位到20個(gè)連鎖群的274個(gè)SSR位點(diǎn)r²評(píng)估，所有檢測(cè)中，平均r²是0.01，大部分（67.10%）r²值顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著。并且，在每個(gè)群中發(fā)現(xiàn)了高連鎖水平標(biāo)記（表1）。

表1、所有檢測(cè)亞群的連鎖不平衡結(jié)果

 

為了給LD 衰減得到一個(gè)特定群體的r²閾值，研究者收集了不連鎖標(biāo)記背景的LD水平，即 r²=0. 27。發(fā)現(xiàn)全基因組LD衰減到1 cM時(shí)的背景就是r²=0. 27（圖4A），并且B亞組LD衰減的比A亞組要快。（圖4B）。

 

 

圖4、104個(gè)品種的LD衰減圖（A）全基因組LD衰減 （B）A、B兩亞組的LD衰減

3、花生遺傳多樣性分析

在單點(diǎn)模型中具有多態(tài)性和共分離的SSR標(biāo)記有554個(gè)。最終，在2～12的群體中獲得了1950個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)有3.50個(gè)等位基因。平均多態(tài)信息含量為0.47。雖然Pop1組包含最多的種質(zhì)，但每個(gè)位點(diǎn)的等位基因（2.70）、基因多樣性（0.25）和PIC（0.22）最低。在四個(gè)亞群中，混合群的主等位基因頻率（0.58）最低，而具有最高的單位點(diǎn)等位基因水平（3.40）及基因多樣性（0.53）和PIC（0.47）水平（表2）。

表2、結(jié)構(gòu)分析分組的多樣性相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

 

4、種子相關(guān)性狀的表型變異分析

分析發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境下種子長(zhǎng)度、寬度、長(zhǎng)寬比及百粒重的情況（圖5，表3-4）

 

圖5、五種環(huán)境下種子相關(guān)性狀表型變化分布圖

表3、花生四種種子相關(guān)性狀表型變化表

 

5、種子性狀全基因組關(guān)聯(lián)定位

總共發(fā)現(xiàn)與表型變異的性狀顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記（MTAs）共30個(gè)，能夠解釋11.22到32.30%的表型（表5）。在五個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到9個(gè)與SL顯著相關(guān)的標(biāo)記，從11.64到31.45%不等。只有2個(gè)標(biāo)記與種子寬度SW關(guān)聯(lián)，但有10個(gè)標(biāo)記與長(zhǎng)寬比關(guān)聯(lián)。9個(gè)標(biāo)記與百粒重關(guān)聯(lián)。

表4、種子相關(guān)性狀相關(guān)性分析

 

表5、種子相關(guān)性狀與標(biāo)記關(guān)聯(lián)情況

 

6、有益等位變異積累分析

從前面的分析中，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與種子表型關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)AGGS1312和AHGA44686之間有24個(gè)單倍性，其中7個(gè)可以用于對(duì)性狀的評(píng)估。

結(jié)論：

• 大部分花生品種在檢測(cè)組合中與SSR標(biāo)記沒(méi)有或弱相關(guān)， B亞組的LD衰減比A亞組要快。
• 發(fā)現(xiàn)30個(gè)與種子性狀顯著相關(guān)的SSR標(biāo)記（P＜1.81x10^-3）。
• 確定了與種子性狀相關(guān)有益等位基因的關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記，以及相關(guān)標(biāo)記等位基因最佳組合。