天昊客戶新文: 體外模擬消化和發(fā)酵中枸杞蜂花粉多糖對腸道菌群的影響

發(fā)稿時間：2018-01-19來源：天昊生物

 

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院近期在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上發(fā)表了枸杞蜂花粉多糖體外模擬消化和發(fā)酵以及其對腸道菌群影響的文章，在這項研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的擴增子測序和生物信息學(xué)分析工作。在恭喜天昊生物客戶發(fā)表微生物文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Simulated Digestion and Fermentation in vitro by Human Gut Microbiota of Polysaccharides from Bee Collected Pollen of Chinese Wolfberry

期刊名：Journal of Agricultural and Food Chemistry  發(fā)表時間：2018年1月

影響因子：3.1540

研究背景：

蜜蜂采集的花粉，由花粉粒，少量蜜蜂分泌的唾液和植物蜜源組成，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、氨基酸、核酸、酚類、脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素。因此，蜂花粉被用作人的膳食補充劑。近年來，蜂花粉多糖及其生物活性的研究已有報道：蜂花粉多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗腫瘤活性等功效。近年來，越來越多的研究證明，植物多糖可被腸道菌群降解，然后通過代謝產(chǎn)物影響宿主的健康，例如短鏈脂肪酸可以降低結(jié)腸pH值和預(yù)防各種疾病，同時多糖能改變腸道群落的組成：茯磚茶中的多糖能顯著刺激擬桿菌屬和普雷沃菌屬，它們是降解膳食纖維的腸道菌群關(guān)鍵成員；靈芝菌絲體多糖能降低高脂飲食引起的腸菌群失調(diào)；杏鮑菇多糖可通過提高擬桿菌科和乳桿菌從而促進免疫因子的分泌量從而有助于宿主的免疫反應(yīng)。然而目前關(guān)于枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)對腸道健康影響的研究鮮有報道。

研究目的：

本文目的是探討枸杞蜂花粉多糖的體外消化和體外發(fā)酵，此外調(diào)查枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)發(fā)酵對短鏈脂肪酸（SCFA）產(chǎn)生和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。

研究思路:

• WBPPS制備和WBPPS特征分析
• 模擬唾液、胃液、小腸液消化WBPPS

• 體外發(fā)酵后還原糖含量、pH 和短鏈脂肪酸（SCFAs）測定
• 體外發(fā)酵后腸道菌群分析

體外厭氧發(fā)酵

1克WBPPS（WBPPS組）或菊粉（INL組）（陽性對照）溶解在100毫升蒸壓基本營養(yǎng)生長培養(yǎng)基中，最終濃度為10毫克/毫升（W / V）；無任何碳源的基礎(chǔ)營養(yǎng)生長培養(yǎng)基作為空白對照（BLK組）。招募3名在3個月內(nèi)不服用任何抗生素的健康志愿者，用無菌磷酸鹽緩沖鹽水（0.1 M, pH 7.2）懸浮糞便制備糞漿（10%, w/v）。微生物發(fā)酵系統(tǒng)由1毫升糞漿和9毫升含有WBPPS或菊粉的培養(yǎng)基組成。發(fā)酵系統(tǒng)在37℃MGC缺氧密閉系統(tǒng)進行，取0, 6, 12, 24 h發(fā)酵樣品進行進一步研究，每個包含3個生物學(xué)重復(fù)。

腸道菌群分析

本研究包括4組體外發(fā)酵：原始糞漿組（OR組）；沒添加任何碳源體外發(fā)酵24 h（BLK組）；添加WBPPS體外發(fā)酵24 h（WBPPS組）；添加菊粉體外發(fā)酵24 h（INL組）。

Miseq測序

細菌測序區(qū)段為：（V4），12個樣本共得到565851條可用序列。

研究結(jié)果：

• 枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)通過熱水提取、乙醇沉淀和冷凍干燥獲得，枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)主要包含甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，摩爾比分別為0.38: 0.09: 0.17: 0.64: 0.22: 0.67: 0.08: 1.03，說明它是雜多糖。
• 此外，在WBPPS的高效凝膠色譜觀察到兩個峰，A部分（主要部分，87.02%）和B部分（13.98%），分子量分別為1340.1和523.2 kDa（圖1a）。

 

圖1 WBPPS（a）、唾液消化后（b）、模擬胃液消化后（c）和模擬小腸液消化后（d）的高效凝膠滲透色譜。

唾液消化WBPPS

•  唾液是第一個消化液樣品，其主要包括唾液淀粉酶，如圖1b所示，唾液處理WBPPS后組分A和B的保留時間和峰面積沒有變化，表明人的唾液不能消化WBPPS。此外唾液處理前后還原糖含量沒有明顯差異（表1），說明WBPPS不能被唾液降解。

表1  唾液、模擬胃液和模擬小腸液消化WBPPS不同時間點的還原糖含量。

 

模擬胃和模擬小腸消化WBPPS

•  如圖1c所示，在模擬胃條件下消化6小時內(nèi) WBPPS的A組分保留時間和峰面積沒有改變，表明A組分保不受模擬胃液的影響。然而B組分逐漸降解，觀察到一個新峰（組分C），組分C是WBPPSB組分的部分降解產(chǎn)物，其分子量為2.68±0.36 kDa。此外，模擬胃液消化中還原糖的含量顯著增加（表1）。然而整個胃消化全過程WBPPS沒有自由單糖的產(chǎn)生（圖2a），表明B組分降解不產(chǎn)生游離單糖，而是誘導(dǎo)還原糖增加。
• 如圖1d所示，模擬小腸消化后WBPPS的A組分保留時間和峰面積沒有改變，表明A組分也不受模擬小腸液的影響。但由于模擬小腸的消化，C組分轉(zhuǎn)化為D組分（分子量1.27 ± 0.03 kDa）。模擬小腸消化過程WBPPS也沒有自由單糖的產(chǎn)生（圖2b, 表1）。
• 以上所有結(jié)果說明模擬胃液和模擬小腸液對WBPPS的降解影響較小，WBPPS可以以一個相對不變的狀態(tài)運送到結(jié)腸，因此預(yù)計腸道菌群可以利用WBPPS，因此本研究想通過新鮮人糞對WBPPS進行體外發(fā)酵，從而評估由于WBPPS體外發(fā)酵對短鏈脂肪酸和腸道菌群產(chǎn)生的影響。

  

圖2  模擬胃液消化后（a）和模擬小腸液消化后（b）WBPPS釋放的游離單糖高效液相色譜。1、甘露糖；2、核糖；3，鼠李糖；4、葡糖醛酸；5、半乳糖醛酸；6、葡萄糖；7、半乳糖；8、木糖；9、阿拉伯糖；10、巖藻糖。

WBPPS體外發(fā)酵對短鏈脂肪酸產(chǎn)生的影響

• 如圖3a所示，WBPPS在體外發(fā)酵過程中逐漸降解，表明WBPPS能被腸道菌群利用。
• 如圖3b所示，發(fā)酵24 h后BLK、WBPPS 和INL組的pH值分別從8.93、7.95和8.90下降到7.59、5.49和4.15，這表明，與BLK組相比WBPPS添加對腸道環(huán)境的pH值有較大影響。此外，在相同的發(fā)酵時間點，WBPPS組的pH值低于BLK組，但是高于INL組，因此推測pH值與體外發(fā)酵過程產(chǎn)生的短鏈脂肪酸水平相關(guān)。

 

圖3  WBPPS體外發(fā)酵不同時間點的高效凝膠滲透色譜（a）；pH值（b）；

• 通過發(fā)酵，WBPPS組總SCFAs濃度從6.40±0.32增加到44.97±1.30 mM（表2），顯著高于BLK組，這表明WBPPS能提高短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。
• 隨著BLK組相比，WBPPS組顯著提高了乙酸和丙酸的產(chǎn)生。通過發(fā)酵，WBPPS組乳酸的濃度從0.13 ± 0.03 (0 h) 增加到1.69 ± 0.08 mM (6 h)，然后下降到0.48 ± 0.05 mM (24 h)，這可能是人類腸道菌群產(chǎn)生的乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌亩替溨舅?。發(fā)酵24小時，BLK組的異戊酸和正戊酸濃度分別比WBPPS組高3.5倍和1.5倍。對于INL組，在每個時間它具有濃度最高的乳酸、乙酸和最低的異丁酸，正丁酸，異戊酸和正戊酸?？傊甒BPPS和INL（菊粉）一樣能促進短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。

表2 體外發(fā)酵不同時間點發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸濃度。

 

WBPPS體外發(fā)酵對腸道菌群的影響

• BLK, WBPPS 和INL各組間在微生物豐度上沒有明顯差異，然而，在微生物多樣性方面WBPPS 和INL組均低于BLK組（表3）。
• 如圖3c和圖3d所示，各組的菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的分離。

表3 不同處理組樣品的α多樣性。

 

 

圖3  各組菌群結(jié)構(gòu)的PCA分析（c）；各組菌群結(jié)構(gòu)的聚類分析（d）。

• 如圖4a所示，所有組主要由厚壁菌門（Firmicutes），擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）。值得注意的是，厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度在體外發(fā)酵24 h后在發(fā)生了很大的變化。梭桿菌門（Fusobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）分別在BLK和INL組相對較多。這說明梭桿菌在無碳源（在BLK組）條件下會過度增長，而INL（菊粉）則會促進放線菌生長。
•  據(jù)報道厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）比值與肥胖密切相關(guān)，這是因為這兩種菌對食物中能量的提取效率不同，一般肥胖患者中的F/B比值也較高。如圖4b顯示，與BLK組相比，WBPPS 和INL組的F/B比值顯著降低，這說明WBPPS 和INL可以通過降低F/B比值來影響宿主健康。

• 從圖4c可以看出，人體腸道糞便中發(fā)現(xiàn)了45種主要菌屬。與BLK組相比，5個菌屬（Prevotella, Dialister, Megamonas, Faecalibacterium, Alloprevotella）在WBPPS組富集，據(jù)報道，高纖維飲食與Prevotella增加密切相關(guān)，這是因為Prevotella包含一組多糖降解酶基因，例如有報道Prevotella和 Xylanibacter這兩種含有纖維素和木聚糖水解基因的菌僅存在于非洲農(nóng)村兒童腸道中，而他們的飲食則富含淀粉、纖維和植物多糖。

 

 

圖4 門水平腸道微生物組成（a）、厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）比值（b）和屬水平腸道微生物組成熱圖（c）。

總結(jié)：

• 本文對枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)的體外消化和發(fā)酵進行研究，枸杞蜂花粉多糖(WBPPS)主要包含甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。
• WBPPS不受人類唾液的影響。WBPPS的A部分（分子量為1340 kDa）在模擬胃液和小腸汁中未分解，而WBPPS的B部分（分子量為523 kDa）則被降解。
• 體外發(fā)酵結(jié)果顯示W(wǎng)BPPS能顯著提高短鏈脂肪酸的生成。
• WBPPS通過增加Prevotella（普氏菌屬）,  Dialister（嗜血桿菌屬）, Megamonas（巨單胞菌屬）, Faecalibacterium（柔嫩梭菌屬）, Alloprevotella（擬普雷沃菌屬）和減少Bacteroides（擬桿菌屬）,  Clostridium  XlVa（梭狀芽胞桿菌XlVa）,  Parabacteroides,  Escherichia/Shigella（埃希氏菌屬/志賀氏菌屬）,  Phascolarctobacterium（考拉桿菌屬）, Parasutterella, Clostridium sensu strict（梭菌屬）、Fusobacterium(梭形桿菌屬)來調(diào)節(jié)腸道菌群的組成。