天昊客戶新文：微生物參與淡水生境中植物凋落物分解

發(fā)稿時(shí)間：2018-01-12來(lái)源：天昊生物

  

中國(guó)科學(xué)院地理與湖泊研究所近期在《FEMS Microbiology Ecology》上發(fā)表了微生物參與淡水生境中植物凋落物分解的文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的擴(kuò)增子測(cè)序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Microbes participated in macrophyte leaf litters decomposition in freshwater habitat

中文題目：微生物參與淡水生境中植物凋落物分解

期刊名：FEMS Microbiology Ecology      

發(fā)表時(shí)間： 2017年    

影響因子：3.72

研究目的

關(guān)于淡水湖泊植物凋落物分解過(guò)程中涉及的水生微生物的知識(shí)仍然很少，本文使用原位試驗(yàn)（150天）對(duì)三種水生植物（茭白、黑藻、杏菜）凋落物分解過(guò)程及其相關(guān)微生物進(jìn)行研究從而回答以下3個(gè)問(wèn)題：

1）  哪些類型的細(xì)菌和真菌參與植物凋落物在表層沉積物的分解？

2）  調(diào)節(jié)植物凋落物分解過(guò)程中的細(xì)菌和真菌群落組成的主導(dǎo)因子是什么？

3）  微生物分解過(guò)程中細(xì)菌和真菌之間的主要關(guān)系是什么？

     研究對(duì)象

     水生植物茭白（Zl）、黑藻（Hv）、杏菜（Np）新鮮葉片從東太湖灣收集。樣品儲(chǔ)存在無(wú)菌塑料袋，放置在冰上并在24小時(shí)內(nèi)并運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室。葉片組織用去離子水輕輕沖洗去除表面雜質(zhì)，然后300×g室溫離心10 min 除去水份。使用消毒刀將預(yù)處理的組織被切成2-5厘米，每片落葉的15克放置在一個(gè)5mm的玻璃纖維網(wǎng)格袋中。將袋子用石塊綁在漁網(wǎng)上，然后在2-3米深的沉積物表面懸掛，所有的漁網(wǎng)都系上了繩子，緊緊地綁在岸上。然后在第0、5、10、20、30、60、90、150、210、270和330天進(jìn)行取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在150天后停止，每個(gè)物種的網(wǎng)袋分別合并然后進(jìn)行后續(xù)分析。另外收集500毫升環(huán)境湖泊水用于化學(xué)分析，例如總氮含量（TN）、總磷（TP）和總有機(jī)碳（TOC）。

植物凋落物組成和水解酶活性測(cè)定：

5 g預(yù)分離組織凍干并磨成均勻的細(xì)粉末，測(cè)定凍干組織的碳含量（c）、氮含量（n %）、磷含量（P %）、纖維素含量、半纖維素含量、木質(zhì)素含量。

離心后，1 g植物凋落物和9毫升PBS緩沖液混合,并在冰上孵育15分鐘，勻漿1510 g離心20 min，上清液用于測(cè)定纖維素酶、木聚糖酶、多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶活性。

DNA提?。?/span>

附生微生物通過(guò)30秒震顫（10 × g）和5分鐘超聲波處理從植物組織脫離下來(lái)。使用0.2μm孔徑的聚碳酸酯過(guò)濾器(Millipore, USA)收集含有附生微生物的懸浮液。該過(guò)濾器存儲(chǔ)在–80度直到進(jìn)一步的核酸提取。該過(guò)濾器被切成小塊，使用E.Z.N.A water DNA kit D552501 (Omega BioTek, Norcross, GA, USA)提取基因組DNA。

測(cè)序技術(shù)：細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序（V4）和真菌18S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序（V9）

數(shù)據(jù)庫(kù)：16S rRNA（RDP數(shù)據(jù)庫(kù)）；18S rRNA（SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)）

研究結(jié)果：

不同植物凋落物的分解率、材料組成和酶活性

◆ 網(wǎng)袋中黑藻（Hv）和杏菜（Np）超過(guò)98%的生物量在90天后消失，而茭白（Zl）超過(guò)64%的生物量在150天后消失（圖1a）。

◆ 基于指數(shù)衰減模型（生物質(zhì)損失轉(zhuǎn)化為分解速率, 用k值表示），不同植物變化明顯不同（圖1b）。在早期階段k值的順序是kZl < kHv < kNp，在后期，kHv值高于kNp。KZl最初先增強(qiáng)后下降，kHv和kNp均表現(xiàn)為持續(xù)下降趨勢(shì)。

圖1 三種植物凋落物在150天試驗(yàn)中的剩余生物量（a）和分解速率（b）

◆ 碳和氮含量隨著降解過(guò)程逐漸減少（圖2）。Hv和Np的磷含量隨著降解過(guò)程逐漸減少，Zl相對(duì)比較平穩(wěn)。

◆ Np的C/N比在降解的初始階段增加，Hv和Zl則是先上升后回落。

◆ 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，纖維素和木質(zhì)素含量在Zl中最高，在Np中最低，半纖維素含量在Hv最高。Zl和Np的纖維素和半纖維素含量隨著分解進(jìn)程逐漸增加而Hv則是下降。隨著時(shí)間的推移所有三種植物的木質(zhì)素含量略有變化，最低值出現(xiàn)在第20天。

◆ 纖維素酶活性在Zl中隨著分解進(jìn)程顯著增加，然而，Hv的纖維素酶活性在頭幾天則受到明顯抑制。木聚糖酶活性在Np樣品中弱增強(qiáng)。多酚氧化酶活性只在Zl和Np樣本中啟動(dòng)。過(guò)氧化物酶活性在Np樣本中顯著增強(qiáng)，但變化幅度較大。

 

圖2 植物凋落物在分解進(jìn)程中的養(yǎng)分含量、物質(zhì)組成和酶活性

在分解過(guò)程中的細(xì)菌和真菌群落組成

◆ 細(xì)菌α多樣性隨著降解時(shí)間顯著增加，三種植物的細(xì)菌α多樣性變化也不同（圖3）：Zl和Np的α多樣性指數(shù)（Shannon–Wiener 和Faith’s PD）隨時(shí)間增加而增加，而Hv的α多樣性指數(shù)增加至30天，然后下降。Pielou’s 指數(shù)增加了30天，然后在接下來(lái)的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，表明細(xì)菌群落的均勻度隨著分解過(guò)程而增加。

◆ 真菌α多樣性隨著降解時(shí)間而增加（圖3）：Hv樣本的真菌OTUs豐度和Faith’s PD隨時(shí)間增加而增加，在第30天達(dá)到最高峰，Zl和Np 樣本則是在10天略有下降，然后增加到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。Zl和Np樣本的Shannon–Wiener和 Pielou’s指數(shù)分別在第5和2天出現(xiàn)最低值，Hv樣本則是先升后降，然后再上升。

 

圖3 三種水生植物分解過(guò)程中細(xì)菌和真菌群落的α多樣性指數(shù)

 ◆細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌是厚壁菌門(mén)，β-變形菌綱，γ-變形菌綱，擬桿菌門(mén)，藍(lán)細(xì)菌，δ-變形菌綱和α-變形菌綱（圖4a）。γ-變形桿菌（Gammaproteobacteria）在所有樣品的初始階段豐度最高，然后逐漸減少，而厚壁菌門(mén)（Firmicutes）, β-變形菌綱（Betaproteobacteria）, δ-變形菌綱

 

圖4（A） 植物凋落物分解過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)及其貢獻(xiàn)

◆ 真菌優(yōu)勢(shì)門(mén)是Cryptomycota（隱真菌門(mén)），Chytridiomycota（壺菌門(mén)），Basidiomycota（擔(dān)子菌門(mén)）。在降解初期，Zl 和Hv樣本豐度最高的是 Basidiomycota（圖4b）。Chytridiomycota在Np樣本的初始階段豐度最高。Cryptomycota的相對(duì)豐度在分解過(guò)程中顯著增加，其在Np，Hv和Zl樣本中的最高值分別出現(xiàn)在第20, 30天和150天。

 

圖4（B） 植物凋落物分解過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)及其貢獻(xiàn)

◆ 從5541個(gè)OTUs中選擇了18個(gè)common bacterial OTUs（圖5a）, 在這18個(gè)OTUs中有7個(gè)OTUs相對(duì)均勻分布在三個(gè)植物中，兩個(gè)屬于Bacteroidetes的OTUs在Zl樣品中更豐富，OTU4227b（屬于Cyanobacteria）是Np樣本特異擁有的。Specific bacterial OTUs則在三個(gè)植物中分布不均勻（除了OTU637b）（圖5b），Zl樣本有8個(gè)Specific bacterial OTUs，Hv樣本有3個(gè)，Nv樣本沒(méi)有任何Specific bacterial OTUs。

◆ 從614個(gè) OTUs中選擇了18個(gè)common fungal OTUs（圖5c），屬于Chytridiomycota和Cryptomycota。4個(gè)OTUs在Hv樣本中富集，特別是OTU610f。 屬于Chytridiomycetes的OTU428f在是Np樣本中富集。屬于Basidiomycota的2個(gè)OTUs在Zl樣本中富集。19個(gè)specific fungal OTUs中大部分只在某種植物中存在（除了OTU113f 和OTU77f）（圖5d）。屬于Opisthokonta的OTU595f只在Hv樣本中存在，屬于Basidiomycota的2個(gè)OTUs和屬于Opisthokonta的2個(gè)OTUs只在Zl樣本中存在，7個(gè)大部分屬于Chytridiomycota的OTUs只在Np樣本中存在。

 

圖5 植物凋落物分解過(guò)程中的common 和specific細(xì)菌OTUs（A和B）以及真菌OTUs（C和D）

微生物群落與凋落物特征以及環(huán)境因素的關(guān)系

◆ RDA分析發(fā)現(xiàn)環(huán)境水體中的總磷（TP）和剩余凋落物的C%與細(xì)菌和真菌群落組成顯著相關(guān)（表1和圖6）。凋落物的C/N比和纖維素酶（cellulase）活性只與細(xì)菌群落組成有顯著相關(guān)性。在分解過(guò)程中，環(huán)境水體中的總氮（TN）、N%、P%、 N/P、木聚糖酶（xylanase）活性與真菌群落組成呈顯著相關(guān)。

表1  水環(huán)境因子和植物特征與細(xì)菌和真菌群落組成的線性回歸分析

◆ 從RDA二維圖可以看出，整個(gè)降解過(guò)程可以分為三個(gè)階段：初期（0天）、中期（5-30天）和后期（60-90天）（圖6a和b）。影響微生物群落動(dòng)態(tài)的因素也各不相同：在初始階段，水體總磷（TP）對(duì)微生物群落組成有顯著影響; 在中期，凋落物的C%和C/N比對(duì)細(xì)菌有影響，而N/P和木聚糖酶（xylanase）活性與真菌群落有一定的相關(guān)性。在后期，纖維素酶（cellulase）活性與細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)明顯同步。

 

圖6  使用RDA揭示環(huán)境和生理因素與細(xì)菌（A）和真菌（B）群落組成的相關(guān)性

 

研究結(jié)論

1.杏菜（Np）凋落物分解是最快的，而茭白（Zl）凋落物分解是最慢的。

2.細(xì)菌群落和真菌群落的α多樣性顯著增加，群落結(jié)構(gòu)隨著時(shí)間推移表現(xiàn)出明顯的變化。

3.對(duì)于細(xì)菌，γ-變形桿菌的相對(duì)豐度下降，而厚壁菌門(mén), β-變形菌綱, δ-變形菌綱和α-變形菌綱增加。在所有三種植物中，真菌的優(yōu)勢(shì)物種Cryptomycota（隱真菌門(mén)）顯著增加。

4.細(xì)菌和真菌與水中總磷量以及凋落物中碳含量顯著相關(guān)。

5.凋落物中氮含量、磷含量和N/P的動(dòng)態(tài)變化對(duì)真菌群落的影響大于對(duì)細(xì)菌群落的影響。而纖維素酶和木聚糖酶活性與細(xì)菌和真菌群落有顯著的相關(guān)性，從而了反映細(xì)菌和真菌在凋落物分解中的生態(tài)位分化和協(xié)同作用。