昊閱讀【Nature Review Genetics】腫瘤轉(zhuǎn)錄組的臨床轉(zhuǎn)化關(guān)鍵之路

發(fā)稿時(shí)間：2018-01-05來源：天昊生物

 

2017年的12月27日，《Nature reviews genetics》（目前世界公認(rèn)的遺傳學(xué)研究領(lǐng)域最頂尖的綜述雜志）在線發(fā)表了名為Cancer transcriptome profiling at the juncture of clinical translation的文章，總結(jié)了二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用以來腫瘤轉(zhuǎn)錄組的變化歷程和其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

測(cè)序技術(shù)剛剛走過40年的歷史，技術(shù)和分析方法不斷革新，這也為腫瘤的復(fù)雜性和異質(zhì)性研究，開發(fā)新的生物標(biāo)志物和治療策略帶來了更多可能。在這篇綜述里，作者將帶領(lǐng)我們一起回顧腫瘤轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的40年歷史變遷，梳理其基本原理和方法的演替，以及這項(xiàng)技術(shù)對(duì)腫瘤臨床帶來的眾多影響和改變。

 

癌癥轉(zhuǎn)錄組學(xué)：四十年征程

 

 

核心事件

1、1977年J.C.Alwin首創(chuàng)Northern blotting，基于雜交檢測(cè)單個(gè)轉(zhuǎn)錄本。

2、1979年完成首個(gè)編碼人胰島素原基因的核苷酸序列cDNA克隆。

3、表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）和逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）首次實(shí)現(xiàn)以無偏和定量的方式鑒定細(xì)胞mRNA表達(dá)水平。

4、1995年Schena等首次進(jìn)行基于雜交的微陣列技術(shù)microarray，實(shí)現(xiàn)了首個(gè)“高通量”轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)。

5、基于Sanger測(cè)序法的SAGE (serial analysis of gene expression)和MPSS(massively parallel signature sequencing)被廣泛應(yīng)用。

6、2005年后，基于新一代高通量測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序登上舞臺(tái)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也被稱為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測(cè)序（Whole Transcriptome Shotgun Sequencing， WTSS），簡稱RNA-seq。

7、2008年，推出了臨床型NanoString是為靶向轉(zhuǎn)錄組學(xué)設(shè)計(jì)的，可直接檢測(cè)條形碼探針標(biāo)記的單個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄子。

8、更多值得期待的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)：如微流控方法用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分離細(xì)胞；空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)用于確定組織樣品或細(xì)胞中RNA的序列和位置；定位轉(zhuǎn)錄組學(xué)用于在固定細(xì)胞的樣品中進(jìn)行原位RNA測(cè)序等。

 

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的每一輪技術(shù)更新，都飛速的應(yīng)用到了腫瘤研究領(lǐng)域。技術(shù)的更新，最直接的體現(xiàn)是數(shù)據(jù)量的指數(shù)級(jí)擴(kuò)張。早先，EST數(shù)據(jù)主要存儲(chǔ)在EMBL或者 GenBank中，而現(xiàn)在則需要更多的數(shù)據(jù)庫出現(xiàn)，去存儲(chǔ)，比對(duì)和應(yīng)用這些數(shù)據(jù)。這里小編整理了幾個(gè)轉(zhuǎn)錄組相關(guān)重要數(shù)據(jù)庫的鏈接，是否正好有您需要的呢？

 

 

RNA連接基因組和表型

腫瘤表型是由遺傳和表觀遺傳畸變的累積共同決定，最后通過特定的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)克隆擴(kuò)大。值得注意的是，雖然不同的腫瘤是獨(dú)立進(jìn)化的，但其中大部分都表現(xiàn)出被廣泛認(rèn)為是癌癥標(biāo)志的相似特征。這些表型需要細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞生物化學(xué)的廣泛改變。例如，轉(zhuǎn)移需要E-鈣粘蛋白表達(dá)和細(xì)胞粘附下降，而免疫逃避可能涉及免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)上調(diào)?；蚧顒?dòng)的變化可以反應(yīng)許多表型，如炎癥，血管形成，凋亡，增殖和基因組不穩(wěn)定性。腫瘤多大程度的獲得這些特征將會(huì)嚴(yán)重影響重要的臨床變量，如增長率，轉(zhuǎn)移指數(shù)和對(duì)藥物的反應(yīng)，最終決定臨床進(jìn)展和成果。

轉(zhuǎn)錄組分析可以通過捕獲定量表達(dá)模式來檢測(cè)和監(jiān)管基因的變化，同時(shí)可以詳細(xì)體現(xiàn)不同表型的基因活動(dòng)差異。此外，很多基因組變異和表觀遺傳事件是可以直接從轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)到或間接推斷得出?，F(xiàn)代癌癥轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要數(shù)據(jù)大致可以分為遺傳數(shù)據(jù)和功能測(cè)量數(shù)據(jù)（上圖），而功能測(cè)量數(shù)據(jù)的有效性主要取決于全基因組測(cè)定的廣度，深度和堿基對(duì)分辨率。

 

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的功能表型挖掘

基于二代測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以從多個(gè)角度挖掘基因在疾病發(fā)生中的特殊功能。作者提到了多個(gè)可能的基因活動(dòng)改變機(jī)制：1）產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)錄本，如采用不同翻譯起始位點(diǎn)等；2）RNA編輯；3）RNA修飾；4）病毒基因組插入以及病毒基因組對(duì)宿主基因組的影響；5）基因融合；6) 等位基因差異表達(dá)等；這里提到的每個(gè)角度，都可能在癌癥發(fā)生中扮演著關(guān)鍵作用。

 

腫瘤表型不僅僅是差異表達(dá)

 

腫瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析可以分為五大類別：1）差異分析側(cè)重于腫瘤與正常組織之間的基因，基因組，通路或網(wǎng)絡(luò)層面的差異挖掘;一般需要至少兩組配對(duì)或不配對(duì)的樣本。2）相對(duì)分析一般比較單個(gè)樣本或一組樣本與整個(gè)隊(duì)列的差異，并試圖確定轉(zhuǎn)錄異常值是否可以作為臨床上有用的標(biāo)記。3）成分分析利用不同細(xì)胞的基因表達(dá)特征類型來評(píng)估（或控制）腫瘤細(xì)胞純度，將樣品解卷積成腫瘤和非腫瘤細(xì)胞類型和表征免疫滲透。4）全局分析是將樣本與大型參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較（通常是泛組織或泛癌種），以表征癌癥的總體轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，如癌癥的標(biāo)志，原發(fā)組織類型或基因型 - 表型關(guān)系。5）綜合分析，是嘗試用其他數(shù)據(jù)補(bǔ)充轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，如DNA測(cè)序，功能基因組學(xué)（例如，DNA CpG甲基化）或臨床數(shù)據(jù)（例如病理學(xué)），然后進(jìn)行整合分析。

RNA作為診斷分析物

RNA作為診斷分析物最大的挑戰(zhàn)在于其不穩(wěn)定性，不穩(wěn)定引起的RNA降解會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)RT-PCR或者轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量。對(duì)于腫瘤組織來說，甲醛固定過程會(huì)大大降低RNA的質(zhì)量，影響后面的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。為了克服RNA降解的問題，實(shí)際上很多團(tuán)隊(duì)也在嘗試改進(jìn)RNA-seq的試驗(yàn)方法。例如15年Genome Research雜志發(fā)表的hybrid capture RNA-seq方法，結(jié)合了外顯子區(qū)域基因捕獲技術(shù)和深度測(cè)序，可以良好的實(shí)現(xiàn)高度降解RNA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)定。大多數(shù)血漿游離RNA（cfRNA）主要來源于凋亡和壞死細(xì)胞，在疾病發(fā)生，如癌癥發(fā)病后會(huì)出現(xiàn)上升。因此，分析cfRNA關(guān)鍵取決于分離細(xì)胞的體外穩(wěn)定性，并需要專們的樣品處理和保存方法。如果分離的細(xì)胞變得不穩(wěn)定，cfRNA就會(huì)被

來自正常細(xì)胞的胞質(zhì)RNA所稀釋。某些RNA其實(shí)特別適合用于開發(fā)診斷marker，例如環(huán)狀RNA對(duì)核酸外切酶具有抗性，在血小板和外泌體富集；腫瘤相關(guān)的miRNA與蛋白存在緊密結(jié)合，可以保護(hù)它們免于

血液RNases的降解；lncRNA具有顯著的腫瘤特異性，部分在癌組織具有非常高的表達(dá)水平。

 

基因表達(dá)特征用于預(yù)后預(yù)測(cè)

在過去的20年中，基因表達(dá)譜已經(jīng)反復(fù)被用來挖掘臨床上有用的特征標(biāo)記。這些標(biāo)記如果確立了分析有效性和臨床有效性，便可以被開發(fā)為生物標(biāo)記物。

生物標(biāo)志物在臨床腫瘤學(xué)中的潛在應(yīng)用跨越疾病的整個(gè)過程。具體而言，生物標(biāo)志物可用于篩選和早期癌癥檢測(cè)。診斷測(cè)試可以幫助確定主要癌癥類型或確定疾病亞型。預(yù)后相關(guān)預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物可用于評(píng)估患者的風(fēng)險(xiǎn)和對(duì)藥物的反應(yīng)，從而指導(dǎo)治療選擇。在治療過程中，標(biāo)志物可以用來檢測(cè)治療早期反應(yīng)或藥物毒性，從而可以在引發(fā)嚴(yán)重副作用前改變治療方案。最后，敏感測(cè)試可以用來檢測(cè)疾病復(fù)發(fā)之前的其他癥狀。

上面提及的這些標(biāo)志物應(yīng)用想法，有部分已經(jīng)開始了商業(yè)化臨床驗(yàn)證。例如，目前臨床上對(duì)于集中主要的癌癥類型都有商業(yè)的預(yù)后標(biāo)志物體系可選，包括乳房（MammaPrint，OncotypeDX和Prosigna），肺（GeneFx），前列腺（Prolaris）和結(jié)直腸（ColoPrint）。目前大多數(shù)基于RNA的生物標(biāo)志物體系都包含多個(gè)基因，主要依據(jù)RT-qPCR檢測(cè)。但是，隨著全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成本急速下滑，一個(gè)分析嵌入多個(gè)檢測(cè)體系很快將成為可能。全面的前期分析可能特別有利于還沒有建立標(biāo)志物體系的癌種監(jiān)測(cè)和回顧性臨床試驗(yàn)的開展。

展望

盡管基于DNA的分析仍然是檢測(cè)驅(qū)動(dòng)癌癥遺傳畸變的主要手段，但RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的獨(dú)特?cái)?shù)據(jù)產(chǎn)出保證了基于RNA的癌癥診斷將會(huì)在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)中有自己的一席之地。不斷創(chuàng)新的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)極大地拓展了我們對(duì)癌癥的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也使得癌癥研究成為生物學(xué)的第一個(gè)數(shù)據(jù)密集領(lǐng)域之一。方法學(xué)上的進(jìn)步將繼續(xù)消除限制RNA分析的空間，測(cè)序成本的快速下降將使更大通量的測(cè)序變成可能。隨著大規(guī)模并行RNA-seq項(xiàng)目的開展，我們期望看到再一次的數(shù)據(jù)量指數(shù)級(jí)增加。癌癥轉(zhuǎn)錄組學(xué)未來的成功將取決于我們是否能夠把這些巨型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為新的癌癥藥物和分子診斷方法。這反過來又將取決于我們確定癌癥表型和剖析癌癥發(fā)生中的精準(zhǔn)和可測(cè)試的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的能力。

總體而言，以RNA為基礎(chǔ)的診斷應(yīng)用，其成功將取決于目標(biāo)RNA的合理選擇，組織處理的持續(xù)改進(jìn)和RNA轉(zhuǎn)錄組分析計(jì)算方法的開發(fā)和驗(yàn)證。