天昊客戶文章：功能性胃腸病患者的腸道細(xì)菌與Toll樣受體表達(dá)相關(guān)

發(fā)稿時間：2017-12-22來源：天昊生物

山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西省人民醫(yī)院消化科王俊平教授課題組近期在《World Journal of Gastroenterology 》上發(fā)表了功能性胃腸病患者的糞便和黏膜菌群與Toll樣受體2／Toll樣受體4表達(dá)相關(guān)性的研究。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的擴(kuò)增子測序和生物信息分析工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。 

英文題目：Faecal and mucosal microbiota in patients with functional gastrointestinal disorders: Correlation with toll-like receptor 2/toll-like receptor 4 expression

中文題目：功能性胃腸病患者的糞便和黏膜菌群與Toll樣受體2/4表達(dá)之間的相關(guān)性

期刊名：World Journal of Gastroenterology     發(fā)表時間： 2017    IF：3.365        

研究背景

最近的研究表明，腸道糞便（LM）微生物群和黏膜（MAM）微生物群組成是不同的，這表明這兩種微生物菌群在腸道微生態(tài)系統(tǒng)中起著不同的作用，腸道糞便微生物群（LM）是整個腸道排出的終產(chǎn)物，而黏膜（MAM）微生物群常常代表某個特定部位的菌群特點(diǎn)，因?yàn)?/span>MAM與宿主緊密接觸，可能在腸道屏障方面有突出的作用，而LM可能在營養(yǎng)代謝和養(yǎng)分捕獲方面起著關(guān)鍵的作用。

Toll樣受體（TLR）是固有免疫中模式識別受體，由胃腸道中的各種細(xì)胞表達(dá)。TLRs能識別各種微生物產(chǎn)物，在先天和適應(yīng)性免疫途徑激活方面起著非常重要的作用，其中TLR2和TLR4是研究最深入的兩個，它們能對微生物膜組件響應(yīng)。已經(jīng)有許多研究證明了TLR信號在微生物引起的慢性炎癥和免疫病中所起的重要作用，TLR可以直接與微生物互作，從而調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)，在一些腸道疾病中，如炎癥性腸?。?/span>IBD）或腸易激綜合征（IBS），發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4的表達(dá)增加，并觀察到微生態(tài)失調(diào)。然而，目前關(guān)于人類腸道菌群與TLR之間關(guān)系的數(shù)據(jù)還比較有限。

研究目的

對功能性胃腸病患者（FGIDs）中腸道糞便（LM）和黏膜（MAM）微生物菌群進(jìn)行比較，研究菌群與Toll樣受體TLR2和TLR4表達(dá)之間的相關(guān)性，從而調(diào)查哪些類型細(xì)菌調(diào)控TLRs的表達(dá)從而影響腸道的功能。

研究對象

共32名18-65歲的中國功能性胃腸病患者（FGIDs），其中包括14名腹瀉型腸易激綜合征患者，14名功能性消化不良（FD）患者，4名其它疾病患者。研究人群男女各半，平均年齡為49（20-65）歲，BMI平均為23.24kg/m²。參加這項(xiàng)研究的受試者在研究前6個月內(nèi)沒有服用糖皮質(zhì)激素、阿片類藥物、益生菌或抗生素類藥物；無系統(tǒng)性合并癥；無過量飲酒史；有胃腸道手術(shù)史或腸道器質(zhì)性疾病的患者被排除在外；所有受試者在參與之前都簽署知情同意書。從32個患者中收集了64個樣本。每個患者同時提供一個糞便樣品和一個結(jié)腸黏膜樣品。

糞便樣品采集和DNA抽提：

在結(jié)腸鏡檢查前在家收集糞便樣品。樣品立即冷凍在-20°C，在6h內(nèi)運(yùn)輸?shù)窖芯恐行?，在分析前一直存放?/span>-80°C，從糞便樣品中抽提細(xì)菌DNA采用QIAamp? DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取DNA。

黏膜樣品采集和DNA抽提：

結(jié)腸黏膜活檢樣本在一次非彈性的結(jié)腸鏡檢查中收集，結(jié)腸黏膜活檢取自降結(jié)腸。從結(jié)腸取出后，活檢樣本立即儲存在-20°C，在6h內(nèi)運(yùn)輸?shù)窖芯恐行?，在分析前一直存放?/span>-80°C，使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) 提取DNA。

qPCR檢測TLR2和TLR4表達(dá)：

從結(jié)腸活檢樣本中使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa, Japan)提取總黏膜RNA，qPCR檢測TLR2和TLR4基因表達(dá)量。

測序技術(shù)

16S rRNA擴(kuò)增子測序（V3-V4）； 

研究結(jié)果

1. 腸道糞便樣品表現(xiàn)出比黏膜樣品更明顯的多樣性和豐富性，并且兩者的菌群結(jié)構(gòu)顯著不同。

2. 腸道糞便（LM）和黏膜（MAM）微生物群之間門分類水平上存在顯著差異。例如LM中的主要菌群為擬桿菌門和厚壁菌門，其次是變形菌門，而MAM中最主要菌群為變形菌門，其次就是厚壁菌門和擬桿菌門。

3. 檢測了所有樣本中TLR2和TLR4的mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR2的表達(dá)與TLR4呈顯著正相關(guān)。

圖3  TLR2的表達(dá)與TLR4呈顯著正相關(guān)性

4. 在腸道糞便樣本（LM）中，無論門、綱、目水平，沒有細(xì)菌與TLR4表達(dá)呈相關(guān)性。而在粘膜樣本（MAM）中，Firmicutes（門水平）；Clostridia（綱水平）；Clostridiales（目水平）；Defluviitaleaceae、Peptostreptococcaceae、Ruminococcaceae（科水平）；Faecalibacterium、Ruminococcus（屬水平）分別與TLR4表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)（圖4）。

5. 腸道糞便（LM）和黏膜（MAM）樣本中的細(xì)菌與TLR2表達(dá)相關(guān)，然而菌群類型卻很不同。在腸道糞便（LM）樣本中，Clostridia、Bacilli（綱水平）；Clostridiales、Lactobacillales（目水平）；Ruminococcaceae、Streptococcaceae（科水平）；Faecalibacterium、Streptococcus（屬水平）分別與TLR2表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)（圖4）。

6. 在黏膜（MAM）樣本中，Bacilli（綱水平）；Lactobacillales（目水平）；Carnobacteriaceae、Streptococcaceae（科水平）；Granulicatella、Streptococcus（屬水平）分別與TLR2表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)（圖4）。

圖4糞便（LM）和粘膜（MAM）樣本相關(guān)關(guān)鍵菌屬和Toll樣受體TLR2和TLR4之間的相關(guān)性。藍(lán)圈

表示正相關(guān)，而紅圈代表負(fù)相關(guān)。

研究結(jié)論

中國功能性胃腸病患者（FGIDs）的腸道糞便（LM）和黏膜（MAM）的微生物組成顯著不同。Toll樣受體的表達(dá)可能是受腸道特定類型細(xì)菌的影響。