Microbiome：飲食改變重塑豬腸道微生物和功能結(jié)構(gòu)

發(fā)稿時(shí)間：2017-12-01來(lái)源：天昊生物

英文題目： Dietary changes in nutritional studies shape the structural and functional composition of the pigs’ fecal microbiome—from days to weeks

中文題目：營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中的飲食改變重塑豬糞便微生物物種和功能結(jié)構(gòu)

期刊名：Microbiome           發(fā)表時(shí)間： 2017.10.27     

發(fā)表單位：德國(guó)霍恩海姆大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院

研究背景：

飲食改變對(duì)腸道菌群影響的研究主要集中在對(duì)感興趣的飲食數(shù)天適應(yīng)后。但是問(wèn)題是，幾天時(shí)間才足以反映微生物對(duì)飲食改變的適應(yīng)。本文研究了飲食改變后4個(gè)星期內(nèi)豬的腸道微生物組從而來(lái)了解這種適應(yīng)所需要的時(shí)間。

研究對(duì)象： 

12頭豬最初都用常規(guī)飲食喂養(yǎng)到12周，在13周的時(shí)候，動(dòng)物們被隨機(jī)分配到四個(gè)實(shí)驗(yàn)性飲食組，喂至第20周。隨機(jī)分為4組。四種飲食中有兩種含有低度可消化（LD）的豌豆粉作為蛋白質(zhì)來(lái)源，剩下的兩種飲食含有高度可消化（HD）的豆粕作為蛋白質(zhì)來(lái)源。這些飲食組中的每一個(gè)都提供高濃度和低濃度鈣磷（CaP）：

（1） R1：豆粕，高度可消化（HD），高鈣磷濃度（CaP）；

（2） R2：豆粕，高度可消化（HD），低鈣磷濃度（CaP）；

（3） R3：豌豆粉，低度可消化（LD），高鈣磷濃度（CaP）；

（4） R4：豌豆粉，低度可消化（HD），低鈣磷濃度（CaP）；

在飲食改變后4個(gè)星期內(nèi)連續(xù)收集糞便樣品，共收集了84個(gè)糞便樣品。有關(guān)實(shí)驗(yàn)和取樣時(shí)間的詳細(xì)資料如下表1。

表1  在跨度4周的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)共收集了7次糞便樣本，用于細(xì)菌16S擴(kuò)增子測(cè)序和蛋白組分析。失敗的DNA分析用X*表示。

 

技術(shù)手段：

•  糞便樣本細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序（V1–V2）；
•  糞便樣本和宿主樣本蛋白組分析（液相色譜/質(zhì)譜分析）；
•  糞便代謝產(chǎn)物（短鏈脂肪酸）分析（氣相色譜分析）

研究結(jié)果：

1、 16S rDNA測(cè)序和蛋白質(zhì)組分析揭示了三個(gè)適應(yīng)期

糞便16S rDNA測(cè)序每個(gè)樣本平均得到57,916± 2139條序列，共得到3497個(gè)OTUs。糞便蛋白質(zhì)組分析分別鑒定到9703個(gè)細(xì)菌蛋白質(zhì)?；?6S rDNA測(cè)序和蛋白質(zhì)組分析結(jié)果進(jìn)行了PCoA分析，按著采樣時(shí)間順序，無(wú)論是16S rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)（圖1a）還是蛋白質(zhì)組分析數(shù)據(jù)（圖1c）所有樣本都分為3個(gè)集群，暗示腸道菌群的適應(yīng)過(guò)程經(jīng)歷了三個(gè)適應(yīng)期：Zero周期（實(shí)驗(yàn)飲食管理前的階段），代謝適應(yīng)期（MA，挑戰(zhàn)性飲食的適應(yīng)期），平衡期（EQ，建立一個(gè)新的合適的腸道菌群）。只有EQ期間的不同濃度鈣磷（CaP）樣本組能夠分開(kāi)，而其它兩個(gè)期間的的不同濃度鈣磷（CaP）樣本組不分開(kāi)這一現(xiàn)象支持只有在平衡期（EQ）重新建立了細(xì)菌群落（圖1b，d）。另外3個(gè)不同適應(yīng)時(shí)期鑒定到各自的OTUs和蛋白質(zhì)，并且3個(gè)不同時(shí)期的OTUs和蛋白質(zhì)相互重疊非常少。

 

 

圖1  16S rDNA測(cè)序（a,b）和蛋白質(zhì)組分析（c,d）結(jié)果揭示了三個(gè)適應(yīng)期。

2、 基于16S rDNA測(cè)序和蛋白質(zhì)組結(jié)果的物種分布

基于16S rDNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)Clostridiaceae，Prevotellaceae 在EQ時(shí)期明顯增加，Peptostreptococcaceae和Bifidobacteriaceae在MA和EQ時(shí)期都明顯增加。而Lactobacillaceae在EQ時(shí)期相對(duì)于Zero時(shí)期則明顯減少（圖2）。

蛋白質(zhì)組結(jié)果支持上述腸道菌群隨著時(shí)間進(jìn)行重塑的結(jié)論。例如Clostridiaceae，Bifidobacteriaceae和Bacteroidaceae相關(guān)蛋白都隨著時(shí)間推移豐度增加。Lachnospiraceae， Veillonellaceae和Erysipelotrichaceae相關(guān)蛋白隨著時(shí)間推移豐度減少。Prevotellaceae在MA時(shí)期明顯減少，而在EQ時(shí)期又恢復(fù)，表明它是Zero和EQ時(shí)期的重要功能細(xì)菌。而actobacillaceae, Spirochaetaceae和 Acidaminococcaceae在MA時(shí)期最高，在Zero和EQ時(shí)期則較少，表明它們?cè)隍?qū)動(dòng)從Zero到EQ時(shí)期轉(zhuǎn)移過(guò)程中起非常重要的作用。

 

圖2 基于16S rDNA測(cè)序和蛋白質(zhì)組結(jié)果表明腸道菌群組成隨時(shí)間依賴性變化。

3、 腸道菌群的功能適應(yīng)

三個(gè)適應(yīng)期中的每一個(gè)特異蛋白質(zhì)被認(rèn)為是腸道菌群功能逐漸轉(zhuǎn)移的重要功能性類別。將每個(gè)適應(yīng)期的蛋白LFQ值與其它2個(gè)適應(yīng)期進(jìn)行比較，具有至少5倍差異的蛋白質(zhì)才被考慮進(jìn)行KEGG途徑的進(jìn)一步功能分類。圖3所示的熱圖總結(jié)了不同適應(yīng)期之間變化最大的途徑，包括與它們表達(dá)有關(guān)的細(xì)菌家族。

Clostridiaceae家族，其豐度在EQ期增加，同時(shí)某些途徑豐度也出現(xiàn)了同步增長(zhǎng)，例如戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換途徑和乙醛酸鹽代謝途徑。Bifidobacteriaceae在EQ時(shí)期的aminoacyl-t-RNA biosynthesis和戊糖磷酸途徑呈中度豐度表達(dá)。Lachnospiraceae在EQ時(shí)期豐度減少造成半乳糖代謝和甘油脂代謝突然下降。

 

圖3菌群成員涉及多種途徑。熱圖顯示了10個(gè)最豐富的細(xì)菌家族在每個(gè)適應(yīng)期選定途徑中的貢獻(xiàn)度。細(xì)菌家族特異的參與到某些途徑中，對(duì)不同適應(yīng)期的變化有貢獻(xiàn)。

圖4對(duì)某些碳水化合物代謝途徑和其相關(guān)細(xì)菌家族進(jìn)行了總結(jié)。在戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換通路，Zero時(shí)期樣品的蛋白質(zhì)在這個(gè)通路中都表現(xiàn)出高豐度，說(shuō)明Zero時(shí)期細(xì)菌群落參與識(shí)別復(fù)雜底物和改善碳和能量吸收（圖4a）。甘油脂代謝相關(guān)蛋白顯示Zero，MA和EQ時(shí)期的細(xì)菌都參與甘油三酯和甘油酯生物合成（圖4b）。對(duì)戊糖磷酸途徑的蛋白研究表明不同的細(xì)菌蛋白參與了這個(gè)相同的功能（圖4c）。參與半乳糖代謝通路的相關(guān)蛋白質(zhì)在Zero和EQ時(shí)期豐度較高（圖4d）。

 

圖4  細(xì)菌群落在選定的碳水化合物途徑中貢獻(xiàn)不同。a戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換; b甘油脂代謝; c戊糖磷酸途徑; d半乳糖代謝; 餅狀圖內(nèi)的不同顏色代表每個(gè)鑒定蛋白質(zhì)相關(guān)的細(xì)菌家族。餅的大小代表蛋白質(zhì)的豐度。餅狀圖框架的顏色代表：紅色，Zero時(shí)期；藍(lán)色，MA時(shí)期；綠色，EQ時(shí)期。當(dāng)餅狀圖很小不能區(qū)分不同適應(yīng)期的明顯差異時(shí)，使用彩色方塊來(lái)表示所鑒定到的蛋白質(zhì)。紅色，Zero時(shí)期；藍(lán)色，MA時(shí)期；綠色，EQ時(shí)期；黃色，所有時(shí)期；灰色，Zero/MA共享；橙色：Zero /EQ共享；紫色：MA /EQ共享。

4、 短鏈脂肪酸合成

使用蛋白組數(shù)據(jù)研究了參與甲酸酯、乙酸乙酯、丙酸酯和丁酸酯生物合成的酶，它們可以作為短鏈脂肪酸生成的指示物。結(jié)果表明丁酸合成酶的豐度隨時(shí)間變化不大，而丙酸合成酶的豐度隨時(shí)間呈逐漸下降趨勢(shì)，甲酸和乙酸合成酶則逐步增加。

短鏈脂肪酸的氣相色譜測(cè)定結(jié)果表明乙酸是最豐富的短鏈脂肪酸，隨后是丙酸和丁酸。除了在低濃度鈣磷（CaP）樣本中增加，丁酸濃度隨時(shí)間變化不大。丙酸濃度在EQ時(shí)期相對(duì)于Zero時(shí)期稍微增加，乙酸濃度則沒(méi)有變化。另外代謝物分析結(jié)果與蛋白組分析結(jié)果沒(méi)有明顯相關(guān)性。

5、 宿主蛋白質(zhì)組受腸道微生物變化的影響

在這項(xiàng)研究中，共鑒定出513種豬蛋白，總體來(lái)看，動(dòng)物蛋白的豐度譜證實(shí)了先前觀察到的逐步適應(yīng)過(guò)程，Zero時(shí)期和EQ時(shí)期具有完全不同的蛋白分布（圖5）。在Zero期發(fā)現(xiàn)的高豐度肌動(dòng)蛋白α1 (GN =ACTA1)和膜聯(lián)蛋白A4 (GN =ANXA4)說(shuō)明宿主參與細(xì)胞生長(zhǎng)，運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞周期等過(guò)程。在MA時(shí)期發(fā)現(xiàn)的高豐度磷脂酶A2 (GN=PLA2G1B)說(shuō)明宿主通過(guò)監(jiān)測(cè)胃粘膜微生物群落結(jié)構(gòu)來(lái)維持胃粘膜功能平衡。在EQ時(shí)期發(fā)現(xiàn)的高豐度酪氨酸和色氨酸酶5激活蛋白(GN=YWHAZ)，Annexin A11（GN = ANXA11）和微管蛋白β4B級(jí)IVB( TUBB4B)說(shuō)明宿主在EQ時(shí)期出現(xiàn)了器官增大和動(dòng)物生長(zhǎng)現(xiàn)象。

 

圖5 宿主蛋白質(zhì)組受腸道微生物變化的影響。Voronoi圖顯示了Zero（a），MA（b）和EQ（c）樣本的宿主蛋白質(zhì)組。蛋白質(zhì)是可視化的多邊形，其面積反映其相對(duì)豐度。

結(jié)論：

• 只豬在飲食改變后4周內(nèi)的7個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，OTUs豐度和蛋白量化值分析表明3個(gè)不同適應(yīng)時(shí)期完全分開(kāi)：第1天的樣本被定義為“Zero期”；第1周和第2周的樣本被合并為“代謝期（MA）”，第3周和第4周的樣本被定義為“平衡期（EQ）”。只有在EQ時(shí)期，根據(jù)CaP補(bǔ)充濃度不同分離是顯著的。
• 蛋白組學(xué)獲得共約9700個(gè)蛋白質(zhì)，可用來(lái)推斷細(xì)菌群落可能的代謝功能。
• 飲食結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致了腸道細(xì)菌群落分類和功能逐漸重塑的過(guò)程，這種適應(yīng)實(shí)際持續(xù)了數(shù)周，盡管通常假定只需幾天的時(shí)間跨度。
• 本研究所獲得的知識(shí)對(duì)未來(lái)營(yíng)養(yǎng)研究的設(shè)計(jì)具有很重要的意義。此外，考慮到豬和人類胃腸道解剖和生理學(xué)之間的高度相似性，目前的研究結(jié)果對(duì)未來(lái)人類相關(guān)營(yíng)養(yǎng)研究的設(shè)計(jì)具有非常重要的參考意義。