Microbiome：綿羊上呼吸道和下呼吸道微生物比較分析

發(fā)稿時(shí)間：2017-11-21來(lái)源：天昊生物

英文題目： Comparing microbiotas in the upper aerodigestive and lower respiratory tracts of lambs

中文題目：綿羊肺部微生物

期刊名：Microbiome           

發(fā)表時(shí)間： 2017.10.27     

發(fā)表單位：英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)羅斯林研究院和皇家（迪克）獸醫(yī)研究學(xué)院

研究背景

最近，在人類(lèi)和動(dòng)物模型中研究了肺微生物在健康和疾病中的重要性。在人類(lèi)中，最近已證實(shí)，肺部微生物是由口腔微生物而來(lái)的，因此本研究想確定綿羊是否相同。                             

研究對(duì)象

40只羊羔（20只雄性和20只雌性）的肺液和上呼吸消化道（口咽）的拭子樣本：平均年齡：48.8 天 ± 0.8，平均體重: 20.6公斤±2.6。在安樂(lè)死之前，唯一的食物來(lái)源母羊的乳汁和牧草。

樣本取樣

1）口咽取樣：羊羔被實(shí)施安樂(lè)死然后從農(nóng)場(chǎng)運(yùn)送到解剖室，使用棉拭子進(jìn)行口咽取樣，拭子儲(chǔ)存在保護(hù)性塑料套中，拭子在采樣點(diǎn)前后擦拭一次，然后拭子轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)新的保護(hù)性塑料套中（內(nèi)含500μL PBS）并儲(chǔ)存在冰上。口咽拭子存儲(chǔ)在?80°C直到下一步的DNA提取。

2）肺液取樣：頸部的腹面被剃光，使用無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)皮膚及皮下組織然后暴露腹面氣管，在暴露的腹面部位確定一個(gè)采樣點(diǎn)，采樣點(diǎn)氣管使用結(jié)扎線和鉗夾法完全封閉。選定的采樣點(diǎn)加熱燒灼，將50毫升PBS經(jīng)燒灼部位注入氣管腔，PBS會(huì)流下胸部的尾部，第二個(gè)夾子立即放在注射部位尾部，以防止倒流、滲漏和潛在污染。將羊羔尸體傾斜，使PBS流向肺部，然后翻倒，液體聚集在氣管腔內(nèi)直到到第二個(gè)夾子的位置。在氣管的腹表面燒灼選擇一個(gè)取樣點(diǎn)，然后用針頭和注射器收集匯集液。每個(gè)樣本平均收集4 ± 1.7 ml肺液，然后放在冰上，肺液13000g離心5分鐘，棄上清液，沉淀用500μL PBS懸浮。肺液被存儲(chǔ)在?80°C直到下一步的DNA提取。

技術(shù)手段

16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序（V2–V3）

研究結(jié)果

1、 方法質(zhì)控

平均每個(gè)樣本得到138,125 ± 29,306條序列，共得到750個(gè)OTUs，Good’s coverage指數(shù)為99.9%，表明樣本中99.9%的細(xì)菌被鑒定到。

2、 羔羊口咽拭子分為兩種不同群落類(lèi)型

使用拉普拉斯近似分析可以將40個(gè)羔羊口咽拭子樣本基于細(xì)菌種類(lèi)分為兩個(gè)獨(dú)立組：口咽型拭子和瘤胃型拭子（圖1, 2），口咽型拭子主要由巴斯德菌科(22%), 曼氏桿菌(14%),梭桿菌 (11%), Bibersteinia trehalosi (8%), 奈瑟桿菌(7%), 莫氏桿菌(6%), 比伯斯坦桿菌 (5%) 。而瘤胃型拭子主要包括普雷沃菌屬（36%）、梭菌目（11%），疣微菌科（7%）、毛螺菌科（6%）和丁酸弧菌屬（6%）?？谘市?/span>拭子和瘤胃型拭子在微生物多樣性方面沒(méi)有顯著差異。

3、 叉狀分枝的口咽菌群與不同肺菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)

肺液樣品最常見(jiàn)的OTUs是馬胃葡萄球菌;（13%），金黃色葡萄球菌（6%）、曼氏桿菌（5%）和普雷沃菌屬（5%）。使用拉普拉斯近似分析肺液沒(méi)有像口咽樣本分成2個(gè)組，然后手工將肺液分成與拭子各自相同的兩組：口咽型和瘤胃型（圖1, 2）：例如普雷沃菌和鞘氨醇桿菌是羊羔指示菌，其來(lái)源于瘤胃型拭子，噬氨副球菌也是羊羔指示菌，其則來(lái)源于口咽型拭子。比較了瘤胃型拭子中優(yōu)勢(shì)OTUs比例和其在肺液樣本中的相應(yīng)比例：平均而言這些OTUs在肺中的比例如下：普雷沃菌（5%）、梭菌目（2%），Ruminococcaceae（3%），毛螺菌科（1%）和丁酸弧菌屬（1%）。總體看來(lái)，羊羔肺部菌群與口咽菌群結(jié)構(gòu)不同。

圖1  PCOA 分析顯示羔羊口咽拭子樣本基于細(xì)菌種類(lèi)分為兩個(gè)獨(dú)立組（紅色和紫色），肺液樣本分成相同的組（綠色和橙色）。肺液樣本和口咽樣本明顯分別聚集。

圖2  羊羔肺液、口咽拭子，提取試劑盒和PBS對(duì)照組發(fā)現(xiàn)的OTUs。綠色：劃分瘤胃細(xì)菌群落的口咽拭子；紅色：劃分口咽型細(xì)菌群落的口咽拭子；粉紅色：劃分瘤胃細(xì)菌群落的肺液；藍(lán)色：劃分口咽型細(xì)菌群落的肺液

4、 肺特有菌群的存在

指示菌種分析確定數(shù)個(gè)OTUs在肺液中相對(duì)于口咽拭子更顯著富集（表2）。開(kāi)始認(rèn)為試劑污染是導(dǎo)致的這個(gè)結(jié)果，因?yàn)橄鄬?duì)于口咽拭子樣本，試劑污染會(huì)對(duì)肺液樣本產(chǎn)生更大的影響，由于其較低的生物量。然而當(dāng)檢查指示菌種時(shí)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)樣品中這些OTUs的比例并不完全相同。在這些指示菌種，最常見(jiàn)的是葡萄球菌，其在肺液中的比例為13.3%，其在對(duì)照組和口咽拭子樣本中比例非常少。

表2  示菌種分析確定數(shù)個(gè)OTUs在肺液中相對(duì)于口咽拭子更顯著富集

結(jié)論

●  口咽拭子樣本通常被與瘤胃常見(jiàn)細(xì)菌（瘤胃型）或上呼吸消化道常見(jiàn)細(xì)菌（口咽型）所主導(dǎo)。

●  肺部微生物不同于上呼吸消化道或?qū)φ?，在肺液中發(fā)現(xiàn)了一些瘤胃相關(guān)細(xì)菌，表明其確實(shí)吸入了瘤胃細(xì)菌。

●  還發(fā)現(xiàn)了幾種細(xì)菌，它們?cè)诜我褐斜壬虾粑婪置谖镏懈S富，其中最主要的為葡萄球菌。

●  與人類(lèi)相反，發(fā)現(xiàn)羊羔肺部與上呼吸消化道菌群并不相同，認(rèn)為這可能與綿羊與人類(lèi)生理和解剖學(xué)上的差異有關(guān)。