Nature：高鹽攝入-腸道菌群-免疫軸重大發(fā)現(xiàn)

發(fā)稿時(shí)間：2017-11-17來源：天昊生物

Nature：高鹽攝入-腸道菌群-免疫軸重大發(fā)現(xiàn)

 

副標(biāo)題：鹽敏感腸道菌群調(diào)節(jié)T_H 17細(xì)胞和疾病

英文題目： Salt-responsive gut commensal modulates T_H 17 axis and disease

中文題目：鹽敏感腸道菌群調(diào)節(jié)T_H 17軸和疾病

期刊名：Nature           發(fā)表時(shí)間： 2017.11.16         

發(fā)表單位：德國馬克斯-德爾布呂克分子醫(yī)學(xué)中心

研究背景：

飲食中的高鹽含量與許多疾病有關(guān)，特別心血管疾病，高鹽飲食（HSD）的有害作用受動(dòng)脈過度緊縮的驅(qū)動(dòng)，并伴隨著高發(fā)病率和高死亡率。迄今為止，大多數(shù)研究都聚焦在腎臟的作用，交感神經(jīng)系統(tǒng)和對(duì)脈管系統(tǒng)的直接影響，然而，一些研究表明免疫系統(tǒng)在這些過程中，將炎性T細(xì)胞與高血壓的發(fā)展聯(lián)系起來，特別是白細(xì)胞介素-17A (IL-17A)產(chǎn)生的CD4⁺ T_H 17細(xì)胞可促進(jìn)高血壓。T_H 17細(xì)胞在自身免疫性疾病中起著有害作用，近年來的研究表明，高鹽環(huán)境可促進(jìn)致病性T_H 17細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，高鹽飲食（HSD）促進(jìn)T_H 17細(xì)胞生殖，從而誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）惡化。活躍髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）誘導(dǎo)的EAE是一種概括了多發(fā)性硬化癥很多方面的疾病模型，盡管它在T細(xì)胞功能的多個(gè)方面不同于轉(zhuǎn)基因EAE模型。HSD和腸道微生物之間的相互作用還沒有徹底研究。目前已經(jīng)知道腸道微生物響應(yīng)飲食成分的波動(dòng)，會(huì)導(dǎo)致暫時(shí)性或持續(xù)性的腸道菌群改變。飲食誘導(dǎo)的微生物群落組成變化可能對(duì)宿主產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，特別是對(duì)T細(xì)胞，目前已經(jīng)知道T_H 17細(xì)胞受某些特定細(xì)菌豐度的影響特別大。因此本文研究了HSD對(duì)腸道微生物和免疫系統(tǒng)的影響。

研究對(duì)象： 喂正常鹽分飲食（NSD）或高鹽飲食（HSD）FVB/N小鼠或志愿者；

技術(shù)手段：16S rDNA擴(kuò)增子測序（V4–V5）；氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）；流式細(xì)胞技術(shù)；宏基因組測序；菌株全基因組測序；qPCR

研究結(jié)果：

1、 高鹽降低小鼠乳酸菌

兩組類型喂養(yǎng)小鼠具有類似的體重和食物攝入量。相對(duì)于NSD喂養(yǎng)的小鼠，HSD喂養(yǎng)的小鼠具有顯著較高的流體和鹽攝入量，但是它們具有相似的腸傳輸。盡管兩組類型喂養(yǎng)小鼠具有類似的微生物組成，但是在喂養(yǎng)14天時(shí)，乳酸菌,Oscillibacter, Pseudoflavonifractor, Clostridium XIVa, Johnsonella, Rothia等幾種菌屬顯著減少，而Parasutterella則顯著增加。

值得注意的是，糞便代謝產(chǎn)物分析結(jié)果表明兩組類型喂養(yǎng)小鼠在中心碳、氮代謝途徑上具有明顯差異。考慮到代謝產(chǎn)物的差異，雖然沒有大規(guī)模的微生物分類學(xué)差異是出乎意料的，但這與兩種飲食的能量含量相同，只是鹽含量不同的事實(shí)卻是一致的。

使用AdaBoost分類器確定了8種具有非平凡特征重要性（圖1A，C）并且準(zhǔn)確率高達(dá)92%（圖1B）的OTUs。這些OTUs的最大相對(duì)豐度范圍是0.04%-19.5%，并且它們對(duì)高鹽飲食（HSD）的反應(yīng)不同（圖1A，C）。最重要的OTU（25%特征重要性）是乳酸桿菌屬的一個(gè)成員，其在喂養(yǎng)HSD后被耗盡（圖1D），乳酸菌消耗非常快速，在喂養(yǎng)HSD 1天后就可以檢測到這種趨勢，在喂養(yǎng)HSD 14天后其具有最低豐度，而當(dāng)重新喂養(yǎng)NSD后，乳酸菌OTU豐度返回基準(zhǔn)水平（圖1D）。

 

圖1  HSD改變小鼠糞便微生物和消耗乳酸桿菌。

由于乳酸菌OTU是與高鹽最密切相關(guān)的細(xì)菌群，因此我們從小鼠糞便中分離出一個(gè)乳酸菌菌株，這個(gè)菌株的16S rDNA序列與擴(kuò)增子測序的V4–V5序列100%相同，因此鑒定為L. murinus。通過qPCR確認(rèn)在喂養(yǎng)HSD后豐度減少（圖1E，F）。L. murinus的全基因組測序結(jié)果與已發(fā)表的2種L. murinus序列有93%同源性。值得注意的是，目前沒有一個(gè)L. murinus菌株是原產(chǎn)于人類微生物群，人類腸道微生物群中最同源的16S序列也只有不到90%核苷酸同源性。

接下來，在體外培養(yǎng)了人相關(guān)的L. murinus菌株和非相關(guān)對(duì)照菌株，并且測試了它們在NaCl濃度增加情況下的生長狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相對(duì)較低NaCl濃度就抑制了人相關(guān)的L. murinus菌株生長，除了唾液乳酸桿菌。

因?yàn)槿樗釛U菌將色氨酸代謝為吲哚代謝物是已知的，因此推測HSD喂養(yǎng)會(huì)減少糞便吲哚代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSD會(huì)顯著降低糞便吲哚乳酸（ILA，圖1G）和吲哚乙酸（IAA）水平，而吲哚甲醛是不變的（IAld）。與無菌小鼠相比，只喂養(yǎng)L. murinus菌株小鼠具有較高水平的糞便ILA，IAA和IAld （圖1H）。

 

圖1  HSD改變小鼠糞便微生物和消耗乳酸桿菌。

2、 L. murinus能改善EAE

腸道菌群最近被確認(rèn)對(duì)多發(fā)性硬化和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）非常重要。HSD對(duì)L. murinus的抑制促使我們調(diào)查口服L. murinus是否能改善HSD誘導(dǎo)的活躍髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）導(dǎo)致的EAE（腦炎小鼠模型）惡化。依靠每日灌胃維護(hù)HSD喂養(yǎng)期間的L. murinus豐度和糞便吲哚代謝物。HSD組小鼠表現(xiàn)出惡化的病程（圖2A），HSD和NSD喂養(yǎng)期間補(bǔ)充L. murinus則可以改善疾病。

3、 L. murinus可減少T_H 17細(xì)胞

通過流式細(xì)胞儀分析了MOG免疫后第3天CD4 ⁺小腸固有層淋巴細(xì)胞（siLPL）產(chǎn)生的IL17A，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSD喂養(yǎng)的小鼠有顯著較高的T_H 17頻率相比于NSD喂養(yǎng)的老鼠，這種頻率可以通過喂養(yǎng)L. murinus來降低（圖2B）。MOG免疫后第17天的脾細(xì)胞和脊髓浸潤淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)L. murinus來降低可顯著減少T_H 17細(xì)胞（圖2C，D）。脊髓組織中的Il17a 和Rorc轉(zhuǎn)錄水平也降低。HSD和L. murinus的效果很可能是對(duì)T_H 17細(xì)胞特異的，因?yàn)閟iLPL，脾或脊髓中干擾素(IFNγ)產(chǎn)生的CD4⁺淋巴細(xì)胞沒有受到影響。

 

圖2  L. murinus喂養(yǎng)會(huì)阻止高鹽誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE），并且減少T _H 17細(xì)胞數(shù)量

為了闡述對(duì)T_H 17細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，我們專注于糞便吲哚代謝物，因?yàn)檫胚岽x物積極誘導(dǎo)EAE是眾所周知的。HSD明顯減少糞便吲哚乳酸ILA，而補(bǔ)充L. murinus則可以防止這種影響（圖3A，B）。接下來研究了ILA在體外對(duì)小鼠T_H 17細(xì)胞分化的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ILA顯著降低T_H 17細(xì)胞分化（圖3C）。然而在MOG免疫的腸道無菌小鼠，HSD沒有改變T_H 17細(xì)胞細(xì)胞的頻率相比于NSD組，這表示腸道細(xì)菌在HSD調(diào)控T_H 17細(xì)胞方面起著至關(guān)重要的作用。

 

圖3  吲哚乳酸ILA的可能功能。

4、 L. murinus降低鹽敏感性高血壓

越來越多的證據(jù)表明T_H 17細(xì)胞在高血壓病發(fā)生過程中起非常重要的角色，而L. murinus可減少T_H 17細(xì)胞，因此想檢測L. murinus處理是否可以降低鹽敏感高血壓。在HSD喂養(yǎng)3周后血壓升高（圖4A，B），而每天L. murinus治療則導(dǎo)致收縮壓顯著降低和舒張壓正常化。

接下來想知道L. murinus治療是否影響鹽敏感性高血壓中的T _H 17細(xì)胞，相比于NSD，HSD導(dǎo)致CD4 ⁺顯著增加siLPL中CD4 ⁺ RORγ t ⁺ T _H 17細(xì)胞頻率，由L. murinus治療則顯著降低這種細(xì)胞頻率（圖4C）。siLPL，cLPL 和脾淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞分析結(jié)果表明相對(duì)于HSD組，L. murinus治療顯著降低T _H 17細(xì)胞頻率（圖4D–F），因此，L. murinus可以阻止HSD導(dǎo)致的T _H 17細(xì)胞增殖，從而改善鹽敏感高血壓。

 

圖4  L. murinus降低鹽敏感性高血壓和減少T _H 17細(xì)胞數(shù)量。

5、 健康人的鹽挑戰(zhàn)

為了在人類中證實(shí)研究結(jié)果，我們進(jìn)行了一項(xiàng)研究男性志愿者的初步研究。參與者鹽攝入量增加14天，我們?cè)?/span>8名受試者的亞組中監(jiān)測了基線血壓和鹽刺激后的動(dòng)態(tài)血壓。與基線相比，高鹽挑戰(zhàn)顯著增加平均收縮壓和舒張壓（圖5A）。由于HSD增加了小鼠T _H 17細(xì)胞的數(shù)量，我們分析了高鹽挑戰(zhàn)前后人體血液中的T _H 17細(xì)胞數(shù)量，外周血淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞結(jié)果顯示CD4 ⁺ IL-17A ⁺ TNF⁺ T _H 17細(xì)胞增加（圖5B）       

為了研究高鹽挑戰(zhàn)對(duì)人體腸道微生物的影響，我們使用宏基因組測序分析了高鹽挑戰(zhàn)前后糞便樣本中乳酸菌的豐度，41.7%的受試者（共12個(gè)）中在基線至少有一個(gè)腸道乳酸桿菌屬陽性，總的來說，我們?cè)诨€檢測到七種不同的腸道乳酸桿菌菌種（圖5C）。在高鹽挑戰(zhàn)之后，在最初存在的十個(gè)乳酸菌種群中有九個(gè)不能在各自的研究對(duì)象被檢測到，這意味著乳桿菌屬的消耗（圖5C）。我們重新分析了121個(gè)時(shí)間推移的健康腸道宏基因組測序數(shù)據(jù)，Kaplan–Meier生存分析結(jié)果表明HSD組的乳酸菌腸道菌群存活率顯著降低（圖5D）。

圖5 高鹽挑戰(zhàn)影響健康人的血壓，T _H 17細(xì)胞數(shù)目和乳酸桿菌。

結(jié)論：

高鹽飲食的生活方式會(huì)導(dǎo)致高血壓和心血管疾病, 高鹽會(huì)通過誘導(dǎo)T _H 17細(xì)胞來驅(qū)動(dòng)自身免疫，從而導(dǎo)致高血壓。本研究發(fā)現(xiàn)高鹽攝入會(huì)影響小鼠的腸道微生物，特別會(huì)消耗乳酸桿菌（Lactobacillus murinus）。因此L. murinus喂養(yǎng)小鼠會(huì)阻止高鹽誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE），并且通過減少T _H 17細(xì)胞數(shù)量來阻止高血壓。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，人體的適度高鹽挑戰(zhàn)降低了乳酸桿菌的腸道存活率，增加了T _H 17細(xì)胞數(shù)量，并且造成血壓升高。本文的研究結(jié)果將高鹽攝入與腸道–免疫軸聯(lián)系在一起，強(qiáng)調(diào)了腸道微生物可作為抗鹽敏感的潛在治療靶點(diǎn)。