天昊客戶新文: 苦丁茶中二咖啡?？鼘幩釋δc道微生態(tài)調(diào)節(jié)作用

發(fā)稿時間：2017-11-14來源：天昊生物

 

南京農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術學院近期在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上發(fā)表了苦丁茶中二咖啡?？鼘幩釋δc道微生態(tài)調(diào)節(jié)作用的文章。在恭喜天昊生物客戶發(fā)表微生物文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Modulating Effects of Dicaffeoylquinic Acids from Ilex Kudingcha on Intestinal Microecology in vitro  

中文題目：苦丁茶中二咖啡?？鼘幩釋δc道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用 

期刊名：Journal of Agricultural and Food Chemistry     

發(fā)表時間： 2017年10月    影響因子： 3.1540

材料方法:

實驗設計

體外發(fā)酵實驗共包含11組：一組不加碳水化合物（BLK）和四組包含不同碳水化合物（Glu，SUC，GOS和INL）；一個原始狀態(tài)組(OR)和五組添加苦丁茶二咖啡?？鼘幩幔╠iCQAs）。

材料與試劑

苦丁茶、葡萄糖（Glu）、蔗糖（SUC）、菊粉（INL）、糖麻（GOS）、乙酸、丙酸、n-butyric、i-butyric、n-valeric、i-valeric、2-ethylbutyric acids、甲醇、甲酸。

diCQAs制備

苦丁茶diCQAs根據(jù)報道方法進行一些修改：苦丁茶用熱水提取，產(chǎn)生的輸液過濾，冷卻至室溫，裝上大孔樹脂柱吸附，用紫外分光光度計在線監(jiān)測柱，用純水洗脫，直到出水在325 nm處不吸收，用乙醇溶液（70%，v/v）洗脫目標部位，收集出水真空濃縮、冷凍凍干。

體外厭氧發(fā)酵

使用糞便微生物體外厭氧發(fā)酵的方法來調(diào)查diCQAs對腸道菌群的影響。糞便樣品從4名健康志愿者獲得（2名男性和2名女性，22 - 28歲），沒有任何胃腸道疾病或在過去的3個月沒服用任何抗生素、益生菌、益生元、瀉藥。將糞便樣品混合在一起，用蒸壓生理鹽水溶液稀釋10次，得到10%（w／v）懸浮液。懸浮液離心4℃，而上清液用于下面發(fā)酵的糞漿。準備基礎營養(yǎng)生長培養(yǎng)基，葡萄糖（Glu）、蔗糖（SUC）、菊粉（INL）、糖麻（GOS）（10 g/L）分別添加到培養(yǎng)基中。微生物發(fā)酵系統(tǒng)由2毫升糞漿和18毫升培養(yǎng)基組成。不添加diCQAs含葡萄糖、蔗糖，糖麻、菊粉、不加任何碳水化合物分別定義為GLU, SUC, GOS, INL,BLK；而添加diCQAs (1.0 g/L) 含葡萄糖、蔗糖，糖麻、菊粉、不加任何碳水化合物分別定義為GLUD, SUCD, GOSD, INLD, BLKD。每個體外發(fā)酵試驗包含3個生物學重復。發(fā)酵系統(tǒng)在MGC缺氧密閉系統(tǒng)進行，37℃孵育24 h。每6小時輕輕搖動，使發(fā)酵系統(tǒng)盡可能均勻。培養(yǎng)后，采樣用于細菌DNA提取，凍在20℃用于SCFA分析。

Miseq測序

細菌測序區(qū)段為：（V4）

研究結(jié)果：

厭氧發(fā)酵后菌群的豐富度和多樣性。

33個樣本的平均測序數(shù)據(jù)量（clean data）為43029 ± 6733 序列。共檢測到316 個OTUs，平均每個樣本檢測到160 ± 21 OTUs。稀釋性曲線和Shannon曲線表明大多數(shù)物種被檢測到（圖1）。

 

圖1 所有樣本的稀釋性曲線（a）和香農(nóng)指數(shù)曲線（b）。

α多樣性指數(shù)如表1所示：INL組微生物多樣性最低，而BLK組微生物多樣性最高。與不添加diCQAs組相比，添加苦丁茶diCQAs增加了α多樣性。無碳水化合物培養(yǎng)時，diCQAs添加會降低微生物多樣性(與BLK相比，BLKD的Shannon指數(shù)更低，而Simpson指數(shù)更高)。據(jù)報道，腸道菌群多樣性與宿主健康密切相關，肥胖個體腸道微生物多樣性顯著低于瘦肉型個體，Shannon指數(shù)與脂肪組織呈顯著負相關。本研究結(jié)果表明：diCQAs能增加腸道菌群多樣性，表明苦丁茶的diCQAs具有通過調(diào)節(jié)腸道菌群抵抗肥胖的能力。

表1 各組α多樣性指數(shù)分析

 

diCQAs對整體微生物結(jié)構(gòu)影響

•  聚類分析結(jié)果表明，所有樣品可分為兩個主要群體：diCQAs添加組和無diCQAs組，無碳水化合物添加發(fā)酵組(BLK和BLKD)與diCQAs添加組比較相近，OR組與無diCQAs組比較類似（圖2a）。
• 不同類型碳水化合物添加發(fā)酵組可以分為不同的亞群，但是它們之間的距離小于diCQAs引起的距離（圖2b）。
• NMDS分析表明diCQAs添加組(GLUD, SUCD, GOSD, INLD, 綠色圈)和無diCQAs組(GLU, SUC, GOS, INL, 藍色圈)在Axis 1完全分離，說明它們之間有明顯差異（圖2c）。
•  CCA分析表明DiCQAs對體外發(fā)酵的影響要明顯大于碳水化合物（葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉）影響，這表明DiCQAs是腸道菌群的主要調(diào)節(jié)因素。

 

圖2  OTUs水平微生物的聚類分析（a）、熱圖分析（b）、NMDS分析（c）、CCA分析（d）。

門和屬水平微生物群落組成

• 所有的發(fā)酵樣品主要包括厚壁菌，擬桿菌，變形菌、放線菌、梭桿菌（圖3a）。
• 添加diCQAs降低了各類型碳水化合物條件下厚壁菌門的相對豐度（圖3b）。
• DiCQAs對擬桿菌的相對豐度影響不大，除了GOS作為碳源時DiCQAs顯著降低其豐度（圖3c）。
• 在所有碳水化合物甚至不加碳水化合物條件下，添加DiCQAs降低了厚壁菌門/擬桿菌門（F / B）比例（圖3d）。腸道菌群的吸收能力與F / B值密切相關，添加DiCQAs導致F / B值降低預示著其抗肥胖的潛在能力。
• 添加DiCQAs顯著增加放線菌豐度，特別是在GOS發(fā)酵組（圖3e）。類似于DiCQAs，槲皮素和兒茶素已被報道可以提高放線菌豐度，但葛根素則沒有這種能力。

 

 

 

圖3門水平微生物組成（A、群落結(jié)構(gòu)柱狀圖；B、厚壁菌門的相對豐度；C、擬桿菌門的相對豐度；D、厚壁菌門/擬桿菌門（F / B）比例；E、放線菌門的相對豐度）。

屬水平微生物組成圖顯示（圖4），DiCQAs可以增加碳水化合物發(fā)酵組中Bacteroides（擬桿菌）,  Bifidobacterium（雙歧桿菌）和 Escherichia/Shigella（大腸桿菌/志賀菌）的豐度，同時降低Prevotella（普氏菌）,  Megamonas（巨單胞菌）, Dialister（嗜血桿菌），Anaerostipes豐度。值得注意的是，GOSD組雙歧桿菌的豐度高于GOS組和其它DiCQAs添加組，表明α- GOS和DiCQAs可協(xié)同促進雙歧桿菌增殖。

 

圖4 屬水平上的微生物組成（A、群落結(jié)構(gòu)柱狀圖；B、熱圖）。

DiCQAs對微生物組成差異的影響

LEfSe分析顯示在葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉存在情況下，添加diCQAs可以分別增加20, 17, 20和22個屬豐度（其中有14個屬是組間共有），也可以分別減少10，10，11，8個屬豐度（其中有6個屬是組間共有）（圖5）。

 

圖5  屬水平上的LEfSe分析(A, GLU vs. GLUD; B, SUC vs. SUCD; C, GOS vs. GOSD; D, INL vs. INLD)。

把無diCQAs組(GLU, SUC, GOS, INL)定義為C群，diCQAs添加組(GLUD, SUCD, GOSD, INLD)定義為CD群。C群和CD群的差異趨勢與上面不同碳水化合物條件得到的比較結(jié)果一致。在門水平，CD組比C組具有較高豐度的放線菌門和變形菌門，而厚壁菌門在C組更常見。在綱水平，添加diCQAs減少了Negativicutes豐度, 增加了放線菌綱,芽孢桿菌綱,γ-變形菌綱，α-變形菌綱豐度。在科水平，添加diCQAs增加了雙歧桿菌科等12個物種豐度，同時抑制了Sreptococcaceae, Prevotellaceae,Veillonellaceae等物種豐度。很顯然，diCQAs表現(xiàn)出對雙歧桿菌增殖顯著的正效應。而雙歧桿菌是一種被廣泛研究的益生菌，它能降低肥胖的風險和發(fā)生率，其豐度與肥胖者內(nèi)毒素水平呈負相關。其促進健康的機制涉及多種作用，如粘附到腸上皮細胞，產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，增強腸道屏障，調(diào)節(jié)免疫反應，以及競爭性排斥病原體。

 

圖6 無diCQAs組(C)和diCQAs添加組（CD）屬水平上的LEfSe分析。

diCQAs對短鏈脂肪酸（SCFA）的影響

大腸是人類產(chǎn)生短鏈脂肪酸的主要場所，棲息在那里的腸道微生物起著至關重要的作用。有機酸，包括乳酸、丙酮酸和乙酸，都來自碳水化合物的發(fā)酵，也可以由微生物進一步轉(zhuǎn)化為丙酸和丁酸。短鏈脂肪酸對維持人體健康具有多功能，并能保護腸黏膜屏障，降低炎癥反應水平，刺激腸胃蠕動。丁酸是一種重要的微生物代謝產(chǎn)物，它是結(jié)腸上皮細胞的主要能量來源，具有調(diào)節(jié)宿主基因表達，細胞分化和凋亡的功能。乙酸能促進腸粘液分泌，丙酸可能在調(diào)節(jié)食欲方面起關鍵作用。

本文短鏈脂肪酸（SCFA）分析結(jié)果如表2所示，在所有的短鏈脂肪酸中，乙酸，丙酸和乳酸是最豐富的有機酸，丁酸也占一定比例。在無任何碳水化合物條件下，diCQAs抑制所有有機酸（除乳酸）和總酸，例如在它們的濃度在BLKD組中較BLK組低。在任何碳水化合物條件下，添加diCQAs可促進乙酸和乳酸產(chǎn)生，例如 (GLUD, SUCD, GOSD)組較(GLU, SUC, GOS)組多；添加diCQAs可減少丙酸和n-butyric（正丁酸）的含量。此外，BLK組的i-butyric, n-butyric，i-valeric 濃度最高。

表2 短鏈脂肪酸、乳酸和總酸的濃度

總結(jié)：

膳食多酚已被視為新的益生元，多酚可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮作用。苦丁茶的多種生物活性可能來源于它的酚類化合物，但苦丁茶中二咖啡酰奎尼酸（diCQAs）對腸道菌群的影響目前沒有被調(diào)查過。研究發(fā)現(xiàn)diCQAs可以提高微生物多樣性，并且diCQAs對微生物的影響高于碳水化合物（葡萄糖、蔗糖、糖麻和菊粉）對微生物的影響。添加DiCQAs可以增加擬桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、志賀氏菌等菌相對豐度，降低瘤胃球菌，小桿菌，巨型球菌等菌相對豐度。DiCQAs也可以通過微生物影響了短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，例如乙酸和乳酸含量增加，丙酸和丁酸生成減少?？偟膩碚f，苦丁茶中的二咖啡?？崴幔?/span>diCQAs）在體外對腸道菌群有顯著的調(diào)節(jié)作用，這表明diCQAs具有被開發(fā)成功能性食品的潛力，通過促進腸道健康預防疾病的發(fā)生。

關于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250測序策略對細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進行測序，使用低循環(huán)數(shù)擴增，保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內(nèi)誤差；數(shù)據(jù)質(zhì)量高，有效序列Q30達到90%以上；加上最新升級的分析內(nèi)容和解釋詳盡的結(jié)題報告，帶您享受極致的微生物擴增子測序體驗。