Nature Communication：動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者腸道菌群宏基因組研究

發(fā)稿時(shí)間：2017-11-01來(lái)源：天昊生物

副標(biāo)題：首個(gè)大隊(duì)列動(dòng)脈粥樣硬化人群宏基因組研究

英文題目：The gut microbiome in atherosclerotic cardiovascular disease

中文題目：動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者腸道菌群宏基因組研究

期刊名：Nature Communication       發(fā)表時(shí)間： 2017.10           影響因子： 12.123

研究對(duì)象：

宏基因組測(cè)序：218例動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者（ACVD）和187例健康對(duì)照者的糞便樣本，PE100測(cè)序。去除低質(zhì)量序列和人類DNA后，有2.2 Tb高質(zhì)量序列（平均每個(gè)樣本得到55.2M序列）能比對(duì)到腸道菌群參考基因集（含有9.9百萬(wàn)個(gè)基因），每個(gè)樣本的序列平均有80.0 ±3.5%能夠比對(duì)上。

研究背景： 

心血管和代謝性疾病統(tǒng)稱為心臟疾?。?/span>CMD），其具有高發(fā)病率和死亡率，并且耗費(fèi)相當(dāng)高的醫(yī)療費(fèi)用。目前腸道微生物組已經(jīng)成為影響人類健康和疾病的關(guān)鍵因素，心臟疾病也不例外。宏基因組學(xué)測(cè)序研究已經(jīng)揭示糖尿病和肥胖患者腸道菌群特征。然而目前只針對(duì)很小樣本量的心血管病患者進(jìn)行了腸道菌群分析。以前的研究表明，腸道菌群代謝物膽堿，磷脂酰膽堿和L-肉堿能產(chǎn)生三甲胺（TMA），而三甲胺在肝臟中被氧化為三甲胺-N-氧化物（TMAO）。目前通過(guò)抑制依賴腸道菌群TMAO的產(chǎn)生被證明是一種治療動(dòng)脈粥樣硬化

很有前途的策略。然而，CMD大型隊(duì)列宏基因組學(xué)研究的缺乏嚴(yán)重阻礙了對(duì)微生物作用的進(jìn)一步探索研究。

研究結(jié)果：

1、 動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者（ACVD）腸道微生物組成

PCA和dbRDA分析表明健康組和ACVD患病組在一些主要菌屬上存在明顯豐度差異（圖1）。例如Bacteroides和Prevotella在ACVD患者中減少，Streptococcus和Escherichia在ACVD患者中增加（圖1B）。但是兩組間在基因豐度和基因多樣性沒(méi)有明顯差異。

 

圖1. ACVD患者腸道主要菌群。A 屬水平腸道菌群PCA分析。218個(gè)患者中有205個(gè)穩(wěn)定型心絞痛、8個(gè)不穩(wěn)定心絞痛、5個(gè)急性心肌梗死。B 前20個(gè)最豐富菌屬的相對(duì)豐度，兩組間有差異菌屬用顏色標(biāo)注。紅色或青色, q-value <0.01; 淺紅色或綠色, q-value <0.05; 黑色, q-value ≥0.05。C屬水平腸道菌群dbRDA分析。

2、 與ACVD相關(guān)的菌種和菌株

基于來(lái)自同一個(gè)微生物基因連鎖的原則，根據(jù)基因豐度的共同變化將所有樣本990萬(wàn)個(gè)基因聚集成為2982個(gè)MLG（MLG >100個(gè)基因）。這是目前為止基于豐度聚類得到的最大基因集，同時(shí)也是最大隊(duì)列人群。組間共有536個(gè)豐度差異的MLG，占到所有MLG相對(duì)豐度的56.3%。其中320個(gè)MLG在ACVD患者中更豐富。

l 腸桿菌科細(xì)菌如Escherichia coli, Klebsiella spp.,和Enterobacter aerogenes在ACVD患者中豐度更高（圖2）。

l 存在于口腔內(nèi)的細(xì)菌，如Streptococcus spp., Lactobacillus salivarius, Solobacterium moorei, Atopobium parvulum在ACVD患者中比健康對(duì)照組豐度更高。

l 與炎癥性腸炎和腸道微生物低豐度相關(guān)的Ruminococcus gnavus在ACVD患者中比健康對(duì)照組豐度更高。

l 以前報(bào)道過(guò)的能降低心臟病藥物地高辛活性的Eggerthella lenta在ACVD患者中豐度更高

l 丁酸鹽產(chǎn)生細(xì)菌包括Roseburia intestinalis和Faecalibacterium cf. prausnitzii在ACVD患者中豐度更低。

l 腸道常見(jiàn)細(xì)菌例如Bacteroides spp., Prevotella copri, Alistipes shahii在ACVD患者中豐度更低。

除了組間菌群豐度差異，組間MLG網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也有差異（圖2）。

l ACVD富集的厭氧生物 Streptococcus spp與ACVD減少的Bacteroides spp.呈負(fù)相關(guān)。

l 同時(shí)Streptococcus spp.與ACVD富集的Enterobacteriaceae呈正相關(guān)。

l ACVD富集的Eggerthella spp., R. gnavus, Clostridium spp.,Erysipelotrichaceae bacterium, Lachnospiraceae bacterium與ACVD減少的產(chǎn)丁酸細(xì)菌Eubacterium eligens, F.prausnitzii, Clostridiales sp. SS3/4呈負(fù)相關(guān)。

 

圖2. ACVD患者和對(duì)照者中組間有顯著差異(q-value <0.05)的MLG（(>100 genes)）關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。紅色節(jié)點(diǎn)代表ACVD中富集；青色節(jié)點(diǎn)代表對(duì)照者富集。節(jié)點(diǎn)的大小表示該MLG的基因數(shù)量。線的粗細(xì)用Spearman相關(guān)系數(shù)值代表：粗線, |cc|>0.7; 中度線, 0.5<|cc|<0.7; 細(xì)線, 0.3<|cc|<0.5。綠線，正相關(guān)；紅線，負(fù)相關(guān)。

3、 腸道微生物和臨床特征之間的聯(lián)系

使用得到的MLG構(gòu)建了一個(gè)隨機(jī)森林分類器（圖3）。ACVD患者的AUC值為0.86，這個(gè)數(shù)字要高于使用TMA裂解酶(CutC/D and YeaW/X)（圖3）得到的AUC值(0.63)，這表明除了TMAO還有其它因素影響ACVD。以前研究發(fā)現(xiàn)ACVD富集編碼膽堿-TMA裂解酶（CUTC）的細(xì)菌，如Erysipelotrichaceae bacterium, C. nexile和S. anginosus（圖2）。除了TMA裂解酶，一些毒力因子在這些細(xì)菌中也可能發(fā)揮作用，如免疫原性脂蛋白A IlpA, PhoP，

phoQ / PhoP雙組分系統(tǒng)，可以部分被宿主抗菌肽誘導(dǎo)。

 

圖3.基于腸道微生物建立的疾病診斷模型。基于405份樣本MLG構(gòu)建的隨機(jī)森林分類器的ROC曲線（紅色）。括號(hào)內(nèi)表示95%的置信區(qū)間。藍(lán)線表示基于TMA裂解酶(CutC/D, YeaW/X)構(gòu)建的ROC曲線。

除了區(qū)分健康認(rèn)和ACVD患者，MLG與一系列臨床指標(biāo)相關(guān)（圖4）。

l ACVD患者富集的K. oxytoca與血清AST（急性心肌梗死標(biāo)志物）、α-羥基丁酸脫氫酶（HBDH）、肌酸激酶同工酶（CKMB）正相關(guān)。

l Klebsiela pneumoniae，Bifidobacterum dentium與HBDH正相關(guān)。

l ACVD富集細(xì)菌包括Streptococcus sp. C300, Streptococcus sp. oral taxon 07173H25Ap, S. salivarius, Oribacterium sinus, Clostridium perfringens與舒張壓或收縮壓呈正相關(guān)。

l ACVD減少的F. cf. prausnitzii與血清中尿酸含量負(fù)相關(guān)，據(jù)報(bào)道飲食過(guò)多紅肉后血清中尿酸含量增加，而進(jìn)行DASH 飲食（停止高血壓的一種膳食方法）會(huì)降低血清中尿酸含量。

l Clostridium hathewayi與總膽紅素TBIL相關(guān)。

 

圖4. ACVD患者富集或減少的MLG與臨床指標(biāo)相關(guān)性。ACVD富集的MLGs用紅圈表示，對(duì)照組富集的MLGs用青色圓圈代表。每個(gè)圓圈的大小表示這個(gè)MLG包含的基因數(shù)。線的粗細(xì)用Spearman相關(guān)系數(shù)值代表。綠線，正相關(guān)；紅線，負(fù)相關(guān)；灰色虛線表示對(duì)照組樣本MLG之間的相關(guān)性。

4、 藥物對(duì)腸道菌群的影響

PERMANOVA分析表明磺達(dá)肝癸鈉、糖尿病藥物阿卡波糖、β-腎上腺素受體阻滯劑美托洛爾對(duì)腸道微生物基因豐度的顯著影響，而阿托伐他?。⑵胀祝?/span>對(duì)腸道微生物基因豐度有相對(duì)程度的影響。使用隨機(jī)森林方法能將ACVD患者（用藥或未用藥）與對(duì)照組分開(kāi)，并且AUC較高（圖5A）。當(dāng)兩種藥物一起分析而不是單個(gè)藥物分析時(shí)，區(qū)分ACVD患者（未用藥）與對(duì)照組的AUC值相對(duì)于ACVD患者（用藥）與ACVD患者（未用藥）的AUC更高，而區(qū)分ACVD患者（用藥）與對(duì)照組的AUC值相對(duì)于ACVD患者（未用藥）與對(duì)照組的AUC更低，這意味著如果患者隊(duì)列中沒(méi)有藥物治療，組間區(qū)別更加明顯，這些結(jié)果表明，急性腦血管疾病狀態(tài)，而不是用藥是鑒別患者群體的主要特征。

此外，本文使用MaAsLin調(diào)查了藥物使用對(duì)腸道菌群特定成員的潛在影響：3個(gè)MLG與美托洛爾使用呈正相關(guān)，2個(gè)MLG與阿托伐他汀使用呈正相關(guān)。另外，藥物使用并未使ACVD相關(guān)菌株或菌種復(fù)雜化。

 

 

圖5. ACVD患者用藥處理隨機(jī)森林表現(xiàn)。A. 使用隨機(jī)森林方法能將ACVD患者（用藥或未用藥）與對(duì)照組分開(kāi)。B. ROC曲線的AUC和約登指數(shù)。

5、 ACVD患者腸道菌群功能改變

l ACVD患者具有更高單糖和氨基酸運(yùn)輸水平（磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)PTS），而維生素生物合成水平更低（圖6,7）。

l ACVD患者具有降低的四氫葉酸合成能力，因此影響同型半胱氨酸代謝（葉酸由于參與同型半胱氨酸代謝導(dǎo)致其在心血管疾病中起作用）。

l ACVD患者多糖（例如glycosaminoglycans）代謝減弱（圖7）。

l ACVD患者的甘油脂代謝和脂肪酸降解升高（圖7），而抗炎性短鏈脂肪酸（SCFA）降低（圖8）。

l ACVD患者的合成乙酸途徑?jīng)]有顯著變化（圖8A），但是TMA裂解酶得到富集（圖8B）。

l ACVD患者的丙酮酸甲酸裂解酶更多，導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生更多的甲酸鹽，從而導(dǎo)致高血壓。

l 接著和其他疾病組（CMDs，obesity，T2D，RA）數(shù)據(jù)進(jìn)行了橫向比較：ACVD患者的MGL Streptococcusspp在肝硬化患者中富集，而Eggerthella并不多。ACVD中富集的E.coli MLGs在其他疾病case-control之間并無(wú)差異，說(shuō)明一些特異或者常見(jiàn)的菌群可以用于診斷ACVD。

 

圖6. ACVD和其他疾病腸道微生物功能模塊的改變。A.PTS傳輸系統(tǒng); B. 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; C. 維生素代謝; D. 乳酸生物合成。紅色，患者富集；青色，對(duì)照者豐富。

 

圖7. 膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、脂質(zhì)代謝途徑和宿主糖降解模塊的差異富集。紅色，患者富集；青色，對(duì)照者豐富。

 

 

 

 

圖8. ACVD和其他疾病腸道微生物特異功能模塊的改變。A.合成SCFA的酶。B. 合成TMA的酶。紅色，患者富集；青色，對(duì)照者豐富。

6、 基于特征微生物的CMDs和肝硬化鑒別。

因?yàn)槿NCMD（ACVD、糖尿病、肥胖）和肝硬化的腸道微生物功能具有比較高的相似性，因此就想能否找到篩選CMDs/肝硬化的MLGs與功能。在50個(gè)確定物種中，包括ACVD富集的MLG，如S. anginosis, S. vestibularis, L. salivarius和ACVD中減少的MLGs，如F. cf. prausnitzii, Bacteroides cellulosilyticus, R.intestinalis用來(lái)作為篩選ACVD患者（補(bǔ)充圖9A）。同時(shí)，可以基于KO建立LASSO模型用來(lái)篩選ACVD患者（補(bǔ)充圖9B），CMDs/肝硬化中排名第一的KO是ACVD中較低的DegS-DegU系統(tǒng)，它可以觸發(fā)生物膜的形成以應(yīng)對(duì)鞭毛的旋轉(zhuǎn)不暢。ACVD中較低的?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在CMDs/肝硬化模型中也很重要。

CMD與肝硬化菌群特征很相似，那么能否找到區(qū)分每種CMD或者肝硬化的特征微生物呢？

結(jié)果發(fā)現(xiàn)Veillonella spp.是鑒別肝硬化的最重要特征菌，B. vulgatus是鑒別二型糖尿病的最重要特征菌，Dorealongicatena是鑒別肥胖的最重要特征菌（補(bǔ)充圖9C）。兩種未分類物種（Acvd-4400 and Acvd-69366）能區(qū)別ACVD與其它兩種CMD。這是首次使用特征菌區(qū)分多種疾病類型。

補(bǔ)充圖9 基于特征微生物的CMDs和肝硬化鑒別。A.篩選CMD患者的重要MLG。紅，ACVD富集；青色，對(duì)照組富集；黑色，無(wú)顯著性差異。B. 篩選CMD患者的重要KO。C. 篩選每種類型CMD的MLG。

總結(jié)：

l 本研究是世界首個(gè)大隊(duì)列ACVD宏基因組研究，利用MLG構(gòu)建的診斷模型可以用來(lái)對(duì)ACVD人群進(jìn)行診斷；

l ACVD 患者中Enterobacteriaceae和Streptococcus顯著增加，對(duì)心血管健康比較重要的幾個(gè)分子的代謝或運(yùn)輸功能也顯著富集。

l 雖然藥物治療是一個(gè)混雜因素，但急性腦血管疾病狀態(tài)，而不是用藥才是鑒別患者群體的主要特征。

l 通過(guò)比較宏基因組數(shù)據(jù)找到區(qū)別3種CMD和肝硬化的特征菌。