SSR在基因精細(xì)定位中的應(yīng)用

發(fā)稿時(shí)間：2017-10-30來源：天昊生物

摘要： SSR與精細(xì)定位

SSR (Simple Sequence Repeats，簡(jiǎn)單序列重復(fù))是一種常用的遺傳分子標(biāo)記。之前小編給大家介紹了SSR在遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)和性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用（學(xué)會(huì)工具“三件套”，SSR分析不再難）。除此之外，SSR還可以在基因的精細(xì)定位中發(fā)揮作用。

要做到“精細(xì)定位”，既需要該區(qū)間存在足夠多的分子標(biāo)記，又需要有足夠多的重組事件發(fā)生，二者缺一不可。沒有足夠的分子標(biāo)記，就無法進(jìn)一步縮小區(qū)域范圍；沒有重組事件發(fā)生，則無法衡量分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的距離。要獲得高密度的標(biāo)記，通常需要在基因組或者轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得序列信息后，利用相應(yīng)生信工具進(jìn)行標(biāo)記開發(fā)；要增加重組事件發(fā)生，往往要靠擴(kuò)大群體來實(shí)現(xiàn)。下面小編就以大豆花葉病毒（SMV）抗性基因精細(xì)定位為例，跟大家分享兩篇近期發(fā)表案例。

1、大豆花葉病毒新的抗性基因Rsc15的精細(xì)定位及鑒定

 

發(fā)表時(shí)間：2017年8月  發(fā)表期刊：Theor Appl Genet. 影響因子：4.132

研究背景：

大豆花葉病毒是一種嚴(yán)重危害大豆產(chǎn)量的病害，前期研究發(fā)現(xiàn)有些大豆品種具有很強(qiáng)的抗病表型，后發(fā)現(xiàn)多個(gè)抗病基因（Rsv1,Rsv3, Rsv4,Rsc3,Rsc4,Rsc7,Rsc8, Rsc14）。作者前期發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的基因Rsc15，本文在此基礎(chǔ)上利用構(gòu)建的RIL群體對(duì)其進(jìn)行精細(xì)定位。

樣品選?。?

抗病品種RN-9與易感品種7605雜交后的F1、F2 (315個(gè)單株)及RIL群體（216 個(gè)F_7:11個(gè)株系植株）。

SSR標(biāo)記的選擇：

15個(gè)SSR標(biāo)記用于初定位結(jié)果的驗(yàn)證 (Satt640, Satt227,Sat_153, Satt322, Sat_213, Sat_246, Satt286, Satt277,Satt557, Satt658, Satt100, Satt708, Sat_238, Staga001, Satt433)，132 SSR標(biāo)記用于精細(xì)定位（108個(gè)區(qū)域SSR標(biāo)記+用SSRHunter軟件新開發(fā)的24個(gè)SSR標(biāo)記）。

表型鑒定：

表1、不同群體材料抗病性表型鑒定

 

表1結(jié)果表明，F2群體抗病和不抗病植株為3:1，RILs群體抗病和不抗病植株為1:1，經(jīng)過卡方檢驗(yàn)，與孟德爾分離比率一致，表明該性狀主要有一個(gè)主效基因控制。

利用RIL群體進(jìn)行精細(xì)定位：

 

圖1、遺傳連鎖圖譜

前期研究，將Rsc15初步定位在6號(hào)染色體Sat_213和Satt286之間的14.6 cM (~1.6 Mb) 區(qū)域（圖1）。通過在父母本植株中對(duì)132個(gè)SSR多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)18個(gè)SSR具有多態(tài)性，用于216個(gè)RIL群體株系基因型檢測(cè)，最終利用Join Map 4.0及MapChart 2.2軟件構(gòu)建遺傳圖譜，根據(jù)最小對(duì)數(shù)似然比LOD為3建立連鎖群，最終把Rsc15定位在了SSR_06_17和 BARCSOYSSR_06_0835之間（圖1）。

 

圖2、SMV抗性基因（Rsc15）的遺傳和物理圖譜

通過分析標(biāo)記在大豆Williams 82參考序列 (Glyma Wm82.a2.v1)中的位置，確定了Rsc15位于95Kb的一段區(qū)域內(nèi)（圖2-c），包含5個(gè)預(yù)測(cè)基因，通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)只有 GmPEX14(Glyma.06g182600)具有多態(tài)性，除此之外，側(cè)翼區(qū)域的Glyma.06g175100, Glyma.06g183500 和Glyma.06g184400也具有多態(tài)性，也歸為潛在的候選基因（圖2-d, 表2）。

表2、候選基因列表

 

后面通過在不同組織及不同病毒處理時(shí)間下候選基因表達(dá)檢測(cè)，以及對(duì)抗逆相關(guān)的H₂O₂濃度、CAT和POD活性檢測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)它們之間存在著高度的相關(guān)性（圖3）。

圖3、RN-9中GmPEX14表達(dá)水平與H₂O₂濃度、CAT和POD活性的相關(guān)性分析

文章總結(jié)：

整篇文章從新SSR分子標(biāo)記的開發(fā)、擴(kuò)大的RIL群體構(gòu)建，到從抗病表型和基因型檢測(cè)，再到精細(xì)定位后候選基因表達(dá)及后續(xù)功能分析一氣呵成，還是比較完整的一篇文章。美中不足就是在功能方面，如果能將抗病品種RN-9中的GmPEX14轉(zhuǎn)到易感品種7605中，并分析其抗病能力的話，文章將更上一個(gè)臺(tái)階。

2、具有SMV抗性的大豆品種Suweon97相關(guān)基因Rsv1-h的精細(xì)定位

 

發(fā)表時(shí)間：2016年8月  發(fā)表期刊：Theor Appl Genet. 影響因子：4.132

樣品選?。?

對(duì)SC6-N 和SC7-N具有抗性的抗病品種Suweon 97與易感品種Williams 82，及其雜交后的F1、F2 (267個(gè)溫室種植單株及1150個(gè)大田種植單株)、F_2:3（73個(gè)單株）和F_3:4（13個(gè)株系）群體。

 

圖4、精細(xì)定位流程圖

SSR標(biāo)記的選擇：

在13號(hào)染色體的之前定位的Rsv1區(qū)域發(fā)現(xiàn)有128個(gè)SSR標(biāo)記，22個(gè)在父母本中顯示出多態(tài)性。

表型鑒定：

表3、F2群體抗病性表型鑒定

 

表3結(jié)果表明，F2群體抗病和不抗病植株為3:1經(jīng)過卡方檢驗(yàn)，與孟德爾分離比率一致，表明該性狀主要有一個(gè)主效基因控制。

 

為了驗(yàn)證是否真正連鎖，選用13_1103和13_1187兩個(gè)標(biāo)記對(duì)1,150 F2單株進(jìn)行群體基因型檢測(cè)，在Suweon 97和Williams 82中具有相同基因型的分別記為1103^SS1187^SS和1103^WW1187^WW，最終分別得到262株和285株。自交后得到F3代，隨機(jī)選取100粒種子種植后進(jìn)行抗病表型檢測(cè)，最終驗(yàn)證了之前的連鎖結(jié)果（圖4）。

 

圖5、重組F2代單株基因型物理圖譜及對(duì)應(yīng)F_2:3植株抗病表型

此外，還檢測(cè)到529株F2^1103SW1187SW雜合植株，另外74株在13_1103和13_1187兩個(gè)標(biāo)記之間發(fā)生重組（1103^SS1187^WW或1103^WW1187^SS），然后利用剩余20個(gè)SSR對(duì)這74個(gè)重組植株進(jìn)行基因型檢測(cè)，進(jìn)一步尋找重組交叉點(diǎn)，最終將Rsv1-h定位在Suweon 97品種的13_1114和13_1115附近區(qū)域（圖5）。

 

 

圖6、13個(gè)重組F_3:4株系基因型物理圖譜及對(duì)應(yīng)抗病表型

種植13個(gè)F_2:3株系，選取在重組位點(diǎn)左右兩段均為純和且分別來自父母本的F_3:4進(jìn)行表型鑒定，進(jìn)一步驗(yàn)證了Rsv1-h在Suweon 97品種的13_1114和13_1115附近區(qū)域（圖6）。

表4、候選基因列表

最后，本研究根據(jù)定位到的~97.5Kb區(qū)域進(jìn)行基因組分析，尋找到8個(gè)可能的候選基因，其中2個(gè)可能與抗病有關(guān)。文章并未對(duì)基因的功能進(jìn)行深入探討。

 

通過對(duì)以上兩篇文章的解析可以發(fā)現(xiàn)，利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行基因精細(xì)定位的思路十分清晰：構(gòu)建群體，篩選有多態(tài)性的SSR，基因型及表型分析，遺傳及物理圖譜定位，根據(jù)基因組信息列出候選基因，進(jìn)行表達(dá)量等功能分析。思路流程理清了馬上開始著手實(shí)驗(yàn)，一篇4分多的文章就在不遠(yuǎn)的前方！

 

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