微生物多樣性經(jīng)典圖之常用搭配圖表解析

發(fā)稿時間：2017-09-28來源：天昊生物

作為一名微生物多樣性研究者，也許我們看到的文獻經(jīng)常呈現(xiàn)出的圖是PCA、PCoA、RDA、CCA等經(jīng)典圖，但是實際上PCA/ PCoA只是直觀的展現(xiàn)出兩組樣本群落結(jié)構(gòu)是否有差異性，但是這種差異是否顯著并沒有展現(xiàn)；另外經(jīng)常用到的環(huán)境因子分析RDA/CCA也只是展現(xiàn)出物種與環(huán)境因子的大體相關(guān)性，具體到哪個物種與哪個環(huán)境因子是正相關(guān)還是負相關(guān)，它們之間的相關(guān)性是否顯著并不能一目了然的看出，今天就給大家展現(xiàn)一下這些微生物多樣性經(jīng)典圖常用的搭配圖表，如果在以后的文章中您能將兩者搭配使用，會更清楚明了，更有說服力喔！

 

Adonis分析

簡介：Adonis分析，即非參數(shù)多元置換方差分析（PERMANOVA），是一種對半度量或度量距離矩陣的離差平方和進行區(qū)分的非參數(shù)統(tǒng)計學(xué)方法，它可分析不同分組因素對樣品差異的解釋度，并使用置換檢驗對劃分的統(tǒng)計學(xué)意義進行顯著性分析。

應(yīng)用：此分析可以作為單獨的統(tǒng)計分析，也可常作為PCA/PCoA/NMDS分析的補充。

關(guān)注點：它選擇兩個或兩個以上條件下的樣品組進行對比分析，檢驗結(jié)果一般看后兩列，其中R2表示樣本分組對群落變異影響的相關(guān)程度，數(shù)值越大，表示該因子對群落變異影響越大，P < 0.05時表示有差異顯著性。

Adonis分析表

	Df	SumsOfSqs	MeanSqs	F.Model	R2	Pr(>F)
GroupInfo	3	1.022945598	0.340981866	3.312575357	0.55401259	0.001
Residuals	8	0.823484641	0.10293558		0.44598741
Total	11	1.846430238			1

注：默認為Bray-curits距離。GroupInfo：分組信息；Residuals：殘值； Df：自由度（組數(shù)-1）；SumsOfSqs：總方差；MeanSqs ：均方（差），即SumsOfSqs/Df；F.Model ：F檢驗值；R²：表示不同分組對樣品差異的解釋度，即分組方差與總方差的比值，R²越大表示分組對差異的解釋度越高；Pr ：表示P值，小于0.05說明本次檢驗的可信性度高。

 

相關(guān)案例：不同施肥制度對叢枝菌根真菌（AMF）群落組成影響

研究目的：作者對使用擴增子測序調(diào)查不同施肥制度（NK，只施加N、K肥； NPK，只施加N、P、K肥； NPKM，施加N、P、K和有機肥； M，只施加有機肥）對玉米根際土壤AMF群落組成的影響。

 

通過不同處理AMF菌落的RDA分析（上圖）可以看出：在不同處理中，AMF群落組成變化很明顯，第一主成分（RDA1）能解釋AMF群落變化的62.22%，根據(jù)是否施加有機肥可以把4組群落明顯分成2組（NPKM和M；NK和NPK），但是這種差異是否顯著呢，就需要用Adonis分析來證明了。

	Df	Sums Of Sqs	Mean Sqs	F.Model	R2	Pr(>F)
+M and -M treatment	1	0.47538	0.47538	7.1113	0.41559	0.003**
Residuals	10	0.66849	0.06685		0.58441
Total	11	1.14387	1

作者接著做了Adonis分析，結(jié)果表明，不施加有機肥（?M）的組別（包括NK和NPK）與有機肥處理（+M）組別（包括NPKM和M）在群落水平上有顯著差異(R² =0.41559, P = 0.003) （上表），因此把4個處理分為兩組（?M和+M）用于隨后的分析。

參考文獻：Impacts of Fertilization Regimes on Arbuscular Mycorrhizal Fungal (AMF) Community Composition Were Correlated with Organic Matter Composition in Maize Rhizosphere Soil. Front Microbiol. 2016, 16;7:1840.（天昊生物客戶發(fā)表文章）

Anosim分析

簡介：Anosim分析，又稱相似性分析，主要用來檢驗組間差異是否大于組內(nèi)差異，從而判斷分組因素對差異的貢獻。如果處理和對照組檢驗結(jié)果|R|值越接近1，表明樣本間所觀察到的物種組成差異確實是處理組引起，而不是組內(nèi)差異造成的干擾。

應(yīng)用：此分析可以作為單獨的統(tǒng)計分析，也可常作為PCA/PCoA/NMDS分析的補充。

關(guān)注點：|R|值越大，表示組間差異越大于組內(nèi)差異，|R|值越小，表示組間和組內(nèi)沒有明顯差異，P< 0.05表示統(tǒng)計具有顯著性。

Anosim分析表

ANOSIM

Number of permutations: 9999

Dissimilarity: bray

statistic R: 0.999736182561667

Significance: 1e-04

注： Number of permutation：表示置換次數(shù)；Dissimilarity：表示選用距離；|R|值越大，表示組間差異越大于組內(nèi)差異，|R|值越小，表示組間和組內(nèi)沒有明顯差異；P<0.05表示統(tǒng)計具有顯著性。

 

相關(guān)案例：擴增子測序分析普洱茶生茶和熟茶的微生物組成

研究目的：使用擴增子測序比較野茶樹新鮮葉片、自然加工普洱茶（生茶）、及熟茶普洱茶（熟茶）之間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。

 

使用PCoA分析了真菌（上圖左）和細菌（上圖右）群落Beta多樣性，結(jié)果均顯示出一致性結(jié)果，即在新鮮葉片（紅色點）和普洱茶葉片生茶（藍色點）和熟茶（橙色點）之間細菌群落組成有明顯差異。但是這種差異是否顯著呢，就需要用Anosim分析來證明了，當然上面講解的Adonis分析也可以用來證明組間群落差異的顯著性。

 

作者通過Anosim和Adonis分析對上述群落相似性進行顯著檢驗（上表），結(jié)果顯示三種不同葉片類型的微生物群落結(jié)構(gòu)均有顯著性差異。

參考文獻：The Microbiome and Metabolites in Fermented Pu-erh Tea as Revealed by High Throughput Sequencing and Quantitative Multiplex Metabolite Analysis. PLoS One. 2016 ,23;11(6):e0157847.

物種與環(huán)境因子顯著相關(guān)性分析

簡介：基于Pearson相關(guān)性分析物種與環(huán)境因子間的相關(guān)性，以相關(guān)系數(shù)|cor|>0.3且P< 0.05作為顯著相關(guān)性篩選閾值，篩選與各環(huán)境因子顯著相關(guān)的物種。選擇相對豐度最高的100個物種繪制相關(guān)性熱圖，以直觀展示各分類水平物種與環(huán)境因子之間的相關(guān)性。

應(yīng)用：此分析可以作為單獨的統(tǒng)計分析，也可常作為RDA/CCA分析的補充。

關(guān)注點：|cor|值越大表示各分類水平物種與環(huán)境因子相關(guān)性越強，*表示顯著性p<0.05，**表示顯著性p<0.01。

物種與環(huán)境因子相關(guān)性熱圖

 

注：每一列代表不同環(huán)境因子，每一行代表不同物種；不同顏色表示兩兩間相關(guān)系數(shù)的大小，藍色越深表示負相關(guān)性越強，橙色越深表示正相關(guān)性越強。*表示顯著性p<0.05，**表示顯著性p<0.01。

相關(guān)案例：不同施肥制度對單作土壤微生物影響。

研究目的：使用擴增子測序調(diào)查三種不同施肥方式（CF：100%化肥； BF：75%化肥+富含木霉有機肥； OF: 75%化肥+混合有機肥）對單作系統(tǒng)土壤微生物的影響。

 

 

如RDA分析（如上圖）和Spearman’s相關(guān)性結(jié)果（如上圖）所示，Acidobacteria、Firmicutes、Proteobacteria與大部分的土壤營養(yǎng)特性正相關(guān)，同時與土壤硝態(tài)氮呈負相關(guān)。相反的是，Actinobacteria、Zygomycota與土壤硝態(tài)氮正相關(guān)，而與速效鉀、總磷、總鉀呈負相關(guān)。土壤總磷與Gemmatimonadetes正相關(guān)，與Glomeromycota、Zygomycota呈負相關(guān)。

參考文獻：Trichoderma-enriched organic fertilizer can mitigate microbiome degeneration of monocropped soil to maintain better plant growth. Plant and Soil. 2017, 416, 181-192（天昊生物客戶發(fā)表文章）