看完這篇，看微生物擴(kuò)增子報告不再煩!

發(fā)稿時間：2017-09-07來源：天昊生物

開學(xué)了，暑假期間送的微生物樣品16S/18S/ITS擴(kuò)增子測序?qū)嶒?yàn)報告到手了，打開一看，哇！數(shù)據(jù)分析結(jié)果有幾十項(xiàng)之多，那么問題來了，我們?nèi)绾螐倪@么多項(xiàng)結(jié)果中快速判斷自己實(shí)驗(yàn)結(jié)果是好是壞，如何按發(fā)表文章的邏輯層次理出一個大概呢？今天小編就給大家展示一下。

 

 

Step1   了解微生物多樣性文章的邏輯層次

 

微生物多樣性文章無論是醫(yī)學(xué)樣本還是農(nóng)牧、環(huán)境樣本其實(shí)寫作套路是固定的，基本上是按如下邏輯層次進(jìn)行：

1.         數(shù)據(jù)質(zhì)控與統(tǒng)計(jì)：統(tǒng)計(jì)每個樣本的測序數(shù)據(jù)量和測序質(zhì)量

2.         Alpha多樣性分析：比較不同樣本間物種多樣性的差異（誰多誰少）

3.         群落組成分析：比較不同樣品間物種組成差異（哪個菌種增多，哪個菌種較少）

4.         Beta多樣性分析：比較不同樣品間整體物種組成的相似性遠(yuǎn)近（組間是否分開，組內(nèi)是否聚在一起）

5.         環(huán)境因子分析：分析樣本菌種與環(huán)境因子或臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性（哪些菌種與環(huán)境因子是正相關(guān)，哪些是負(fù)相關(guān)）

 

 

Step2   了解擴(kuò)增子測序?qū)嶒?yàn)報告的結(jié)果層次

 

了解了微生物多樣性文章的邏輯層次，那么再看看16S/18S/ITS擴(kuò)增子測序?qū)嶒?yàn)報告中的數(shù)據(jù)分析流程圖，您是不是就一目了然了呢，感覺契合度很高呢!

 

當(dāng)然每一項(xiàng)分析根據(jù)目錄從交付文件中具體查看。

 

Step3  抓看文章發(fā)表重點(diǎn)圖表

邏輯層次了解了，下一步就要從每個層次中重點(diǎn)看一下文章發(fā)表所需的常用圖表了。

 

 

PART1 數(shù)據(jù)質(zhì)控與統(tǒng)計(jì)

 

首先我們需要重點(diǎn)看每個樣本的有效測序數(shù)據(jù)量（即表格中的優(yōu)化序列條數(shù)）和Q30，這些是需要在文章中做簡單描述的，例如質(zhì)量控制后，擴(kuò)增子測序共產(chǎn)生_個reads，平均每個樣本產(chǎn)生_個reads。

 

 

 

 

 

結(jié)果目錄：Statistics/seqStat.xlsx

 

 

PART2  Alpha多樣性分析

 

1、  多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表（文章必需圖）

 

目的：用于度量群落生態(tài)中的每個樣本的物種豐富度和多樣性。

 

 

計(jì)算菌群豐富度的指數(shù)：

（1）Observed_species ：直接觀測到的OTU的個數(shù)，數(shù)值越大代表物種越多。

（2）Chao1：用于估計(jì)樣品中物種總數(shù)，數(shù)值越大代表物種越多。

（3）ACE：用于估計(jì)樣品中物種總數(shù)，數(shù)值越大代表物種越多。

 

計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)：

（1）Shannon：數(shù)值越大代表群落多樣性越高。

（2）Simpson：數(shù)值越大代表群落多樣性越低。

（3）InvSimpson：1-Simpson指數(shù)值，數(shù)值越大代表群落多樣性越高。

 

計(jì)算菌群多樣性的覆蓋率：

（1）Coverage：用來評估樣本序列覆蓋度。數(shù)值越大代表越能捕捉樣品的完整多樣性。

 

結(jié)果目錄：Alphadiversity/DiversityIndex/alpha.diversity.index.xls

 

 

2、  多樣性指數(shù)差異分析

 

目的：用以評估組間物種多樣性是否存在顯著差異，在文章中一般是這樣描述的：與健康人群相比，患者腸道菌群多樣性指數(shù)顯著增加或減少。

 

 

圖形解釋如下：

 

結(jié)果目錄：Alphadiversity/DiversityIndex/Alphadiversity

 

 

3、  稀釋性曲線（文章必需圖）

 

目的：1）通過對比不同樣本的稀釋曲線（畫一條垂直線）可以比較不同樣本間物種豐富度的差異；2）可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理：如果樣本曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，如果樣本曲線沒有平坦，說明測序數(shù)據(jù)量不足。

 

結(jié)果目錄：AlphaDiversity/Rarefaction/Samples_Rarefaction_Curves.pdf

 

 

PART3  群落組成分析

 

 

1、  多樣本群落結(jié)構(gòu)柱狀圖（文章必需圖）

 

目的：在某一分類水平上將每個樣本的物種組成繪制成柱狀圖展示在一張圖上，可以尋找所有樣本的優(yōu)勢菌種、組間物種組成差異，一般在文章中分別在門、綱、目、科、屬、種水平上尋找組間的差異菌種。

問題解疑：

Unclassified：沒有被研究的新物種或者所測區(qū)段太短不足以在某個分類水平獲得分類

No_Rank: 因?yàn)閿?shù)據(jù)庫沒有收錄相應(yīng)序列信息，導(dǎo)致在某個分類水平上沒有獲得明確分類

結(jié)果目錄：Community/Barplot /*.taxon.Community.Barplot.pdf

 

 

PART4  Beta多樣性分析

 

1、  PCA/PCoA分析 （文章必需圖）

 

目的：用來分析不同樣品群落組成的差異，組間樣本距離越遠(yuǎn)，表明組間群落組成差異越大；同一組內(nèi)各生物學(xué)重復(fù)樣本距離越近，表明群落組成越相似。

 

 

常見問題：組間差異不明顯，組內(nèi)樣本不能聚成一團(tuán)，這個問題有可能是樣本個體間差異大，沒有嚴(yán)格按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)篩選樣本導(dǎo)致的，這就需要前期加大樣本量從而可以把異常樣本刪除掉，為了保證刪除異常樣本后還具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此建議：醫(yī)學(xué)樣本：每組最少30個個體；鼠：每組最少10個樣本；土壤樣本：每組至少5個樣本。

 

 

結(jié)果目錄：

PCA分析：BetaDiversity/PCA

PCoA分析：BetaDiversity/PCoA

 

2、  Lefse分析  （文章必需圖）

 

目的：找到每組中豐度顯著富集的差異物種，條形圖越長代表這個物種越顯著富集，因此要著重看一下排名最高的前幾位菌屬與樣品表型是否相關(guān)。

 

 

結(jié)果目錄：BetaDiversity/Lefse

 

 

PART5  環(huán)境因子分析

 

1、  物種與環(huán)境因子顯著相關(guān)性分析（文章檔次提升必需圖）

 

目的：分析各物種與環(huán)境因子間的相關(guān)性，可以評估環(huán)境因子具體影響到了哪些物種。不同顏色表示兩兩間相關(guān)系數(shù)的大小，藍(lán)色越深表示負(fù)相關(guān)性越強(qiáng)，橙色越深表示正相關(guān)性越強(qiáng)。

結(jié)果目錄：EnvironmentFactors/Correlation

 

常見問題：醫(yī)學(xué)樣本取樣時往往會忽略收集環(huán)境因子（臨床指標(biāo)）信息，一篇好的微生物文章要把微生物和疾病真正聯(lián)系起來，不但要看組間的群落結(jié)構(gòu)差異，還要把臨床指標(biāo)和微生物進(jìn)行相關(guān)性分析，確定哪個菌種與疾病相關(guān)指標(biāo)呈相關(guān)還是負(fù)相關(guān)，下面我們就看幾個案例。

 

 

2、RDA/CCA分析（環(huán)境文章必需圖）

 

目的：用來反映菌群與環(huán)境因子（環(huán)境樣本理化指標(biāo)）之間關(guān)系。箭頭射線代表不同的環(huán)境因子，射線越長表示該環(huán)境因子影響越大。

 

結(jié)果目錄：EnvironmentFactors/RDA_CCA

 

 

看完這些，相信您已經(jīng)抓住微生物多樣性實(shí)驗(yàn)報告的精髓，可以在很短時間內(nèi)就可以快速判斷自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否達(dá)到預(yù)期，當(dāng)然我們天昊微生物擴(kuò)增子報告中除了這些常見的圖表，還有很多其它精彩而又個性化的圖表等待您來探究，讓您的微生物文章更上一層樓。