37個(gè)RNA-seq工具大PK，教你數(shù)據(jù)處理方法如何選擇

發(fā)稿時(shí)間：2017-08-24來源：天昊生物

摘要： RNA-seq方法大整合

RNA-seq是轉(zhuǎn)錄組研究的一項(xiàng)重要技術(shù)方法，自從它誕生以來，已經(jīng)發(fā)展了上百種分析工具。人們往往更加熱衷于對(duì)新的分析工具的開發(fā)，而忽視了對(duì)已有工具的系統(tǒng)性整合。近期在NC上發(fā)表了一篇通過對(duì)RNA-seq廣譜性分析文章，獲得對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)更加全面的認(rèn)識(shí)。

 

期刊名：Nature Communications      發(fā)表時(shí)間： 2017年7月    影響因子： 12.124

 

RNA-seq技術(shù)的廣泛應(yīng)用為轉(zhuǎn)錄組研究迎來了一個(gè)新時(shí)代。根據(jù)研究內(nèi)容的方向，精度、速度和成本要求不同，科研人員需要對(duì)包括采取何種具體測序方法流程、樣品類型、所需的分析結(jié)果，以及基因組研究現(xiàn)狀和計(jì)算數(shù)據(jù)處理可用資源等內(nèi)容進(jìn)行權(quán)衡。因?yàn)樯婕暗膯栴}復(fù)雜多樣，如何找到一種最佳的工作流程，在成本和性能要求基礎(chǔ)上，通過對(duì)RNA-seq分析中涉及到的各個(gè)不同環(huán)節(jié)進(jìn)行最優(yōu)選擇，便成為是至關(guān)重要的問題。

 

為了解決上述問題，研究者提出了一個(gè)綜合性RNA-seq方案 — RNA-Cocktail法，這種方法分析了一系列RNA-seq工作流程，除了分析RNA表達(dá)情況之外，研究者還對(duì)RNA變異識(shí)別、RNA編輯和融合檢測方法進(jìn)行了評(píng)估。他們利用39個(gè)分析工具，對(duì)生殖系、癌癥和干細(xì)胞的15個(gè)樣本數(shù)據(jù)集進(jìn)行了120個(gè)組合的490項(xiàng)分析，實(shí)現(xiàn)了工作流程的更高精度化，提供了更多生物學(xué)相關(guān)預(yù)測。流程代碼下載網(wǎng)址：http://bioinform.github.io/rnacocktail/。

 

RNA-seq數(shù)據(jù)集來源:

RNA-seq分析設(shè)計(jì)方案:

圖1、RNA-Cocktail分析設(shè)計(jì)方案

 

用于比較的分析軟件列表:

基于有參序列的轉(zhuǎn)錄本鑒定：

圖2、不同序列比對(duì)策略性能比較

研究者比較了TopHat、STAR14和 HISAT2三種最常用的拼接軟件，最終從整體的比較結(jié)果看，HISAT2比STAR14和TopHat分別快了大約2.5倍和100倍（圖2）。

之后，研究者又比較了Cufflinks和StringTie這兩個(gè)常用的基于比對(duì)的轉(zhuǎn)錄組工具，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然Cufflinks在基因?qū)用娴臋z測要比StringTie靈敏一些，但是StringTie比Cufflinks多預(yù)測50–200% 的轉(zhuǎn)錄本，并且比Cufflinks分析速度快約60倍。

De novo 轉(zhuǎn)錄本組裝：

當(dāng)缺少參考基因組或者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時(shí)，測序reads的de novo組裝可以被用來構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本。本研究分析了三種廣泛應(yīng)用的工具：Trinity、Oases和SOAPdenovo-Trans。對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Oases在所有樣本中，具有最高的N10到N50值，表明它具有發(fā)現(xiàn)長轉(zhuǎn)錄本的優(yōu)勢（圖3）。在對(duì)ExN50的測試中，Oases同樣具有更有效的捕捉低表達(dá)基因的能力。而考慮到較低內(nèi)存配置及計(jì)算需求時(shí)，SOAPdenovo-Trans則是最為高效的方法。

圖3、不同de novo轉(zhuǎn)錄本組裝技術(shù)性能比較

差異表達(dá)分析：

RNA-seq的一個(gè)重要目標(biāo)就是鑒定不同樣本和條件下基因表達(dá)差異情況，人們開發(fā)出多種檢測方法，比如DESeq2、limma、edgeR、Cuffdiff、Ballgown和sleuth等。這些工具用于檢測SEQC樣品中的1001個(gè)表達(dá)差異基因的性能差異，結(jié)果表明，DESeq2較為明顯的優(yōu)于其他方法（圖4）。

圖4、不同基因表達(dá)差異工具性能比較

RNA-seq變異分析：

除了檢測差異表達(dá)信息之外，RNA-seq數(shù)據(jù)還可以用于鑒定基因組和轉(zhuǎn)錄組重要的變異情況。

圖5、不同變異識(shí)別（a-c）、RNA編輯（d-e）和RNA融合（f）檢測方法比較

在變異識(shí)別中，常用到SAMtools mpileup和GATK’s HaplotypeCaller工具。通過與其他環(huán)節(jié)多種工具的組合對(duì)比發(fā)現(xiàn)，SAMtools和GATK具有較為類似的處理時(shí)間和性能。RNA編輯作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要過程，可以影響序列功能及表達(dá)水平，本研究重點(diǎn)對(duì)GIREMI工具進(jìn)行了分析。RNA-seq的另外一個(gè)重要應(yīng)用就是對(duì)融合基因的檢測，比較常用工具JAFFA、 STAR-Fusion、TopHat-Fusion、FusionCatcher和SOAPfuse，以及長片段工具IDP-fusion和Iso-Seq的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)usionCatcher和IDP fusion表現(xiàn)出更高的靈敏性和準(zhǔn)確性（圖5）。

 

高準(zhǔn)確性工作流程—RNA-Cocktail流程：

圖6、RNA-Cocktail流程圖

綜合上述工具比較分析結(jié)果，研究者對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)表現(xiàn)更好的工具進(jìn)行整合，提出了RNA-seq分析高準(zhǔn)確性工作流程—RNA-Cocktail（圖6）在數(shù)據(jù)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，該流程優(yōu)于之前的其他工作流程，如Galaxy和Grape等方法。

 

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