天昊生物推出Illumina 850k甲基化芯片檢測(cè)服務(wù)

發(fā)稿時(shí)間：2017-06-19來(lái)源：天昊生物

Illumina 850k (EPIC)甲基化芯片技術(shù)介紹

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技術(shù)簡(jiǎn)介：

DNA甲基化在調(diào)控基因表達(dá)過(guò)程中起著非常重要的，它能使細(xì)胞處于一個(gè)特殊狀態(tài)，抑制病毒和非寄主元件的表達(dá)，促進(jìn)對(duì)環(huán)境刺激的反應(yīng)。異常的DNA甲基化（高或低）及對(duì)基因表達(dá)的影響已經(jīng)參與到許多疾病過(guò)程中，包括癌癥，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，老化和發(fā)育。

為了更經(jīng)濟(jì)有效地進(jìn)行DNA甲基化分析，Illumina公司提供了一個(gè)強(qiáng)大的甲基化分析平臺(tái)： Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip （DNA甲基化850K芯片），不但包含了原450K芯片90%以上的位點(diǎn)，并額外增加了增強(qiáng)子區(qū)的350,000個(gè)位點(diǎn)，可以對(duì)正常樣本和FFPE樣本單個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行定量甲基化檢測(cè)，該芯片是以其全基因組覆蓋度和精準(zhǔn)度，目前成為表觀基因組關(guān)聯(lián)研究（EWAS）的最理想解決方案。

 

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

 

全基因組覆蓋：

每個(gè)樣本檢測(cè)853,307個(gè)CpG位點(diǎn)，全面覆蓋CpG島、啟動(dòng)子、編碼區(qū)及增強(qiáng)子。覆蓋CpG島、RefSeq基因、ENCODE開(kāi)放染色質(zhì)、ENCODE轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、FANTOM5增強(qiáng)子區(qū)域。850K芯片包含以下位點(diǎn)：

l   CpG島以外的CpG位點(diǎn)；

l   人類(lèi)干細(xì)胞中鑒定到的非CpG甲基化位點(diǎn)（CHH位點(diǎn)）；

l   在正常樣本VS腫瘤樣本（多種類(lèi)型腫瘤）以及不同類(lèi)型組織中鑒定到的差異甲基化位點(diǎn)；

l   FANTOM5項(xiàng)目鑒定到的增強(qiáng)子區(qū)域；

l   ENCODE項(xiàng)目開(kāi)放染色質(zhì)和增強(qiáng)子區(qū)域；

l   DNase超敏位點(diǎn)；

l   miRNA啟動(dòng)子區(qū)域；

l   原450K芯片＞90%的位點(diǎn)；

 

圖2  EPIC 甲基化芯片提供了基因區(qū)域廣泛高密度的覆蓋。

 

簡(jiǎn)化的工作流程：

Infinium Methylation EPIC甲基化芯片提供一個(gè)精簡(jiǎn)的工作流程，不需要PCR，樣本量要求低（最低只需要250ng DNA）。

 

高質(zhì)量的數(shù)據(jù)：

Infinium Methylation EPIC甲基化芯片采用Infinium I和 Infinium II技術(shù)（圖4），從而提高了甲基化分析的覆蓋深度。Infinium II技術(shù)采用單一磁珠類(lèi)型的變性寡核苷酸探針，即使序列中有多達(dá)三個(gè)甲基化或非甲基化的CpG位點(diǎn)，也不會(huì)對(duì)待測(cè)位點(diǎn)結(jié)果造成影響。

圖4  EPIC 甲基化芯片采用Infinium I和 Infinium II技術(shù)從而提高了覆蓋度。Infinium I技術(shù)針對(duì)每個(gè)CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)了兩種磁珠類(lèi)型：M型磁珠（M型磁珠尾部為G，用來(lái)檢測(cè)甲基化位點(diǎn)）和U型磁珠（U型磁珠尾部為A，用來(lái)檢測(cè)未甲基化位點(diǎn)），每種磁珠類(lèi)型分別針對(duì)甲基化或非甲基化兩種狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)M型磁珠與U型磁珠熒光信號(hào)來(lái)計(jì)算位點(diǎn)的甲基化程度。Infinium II技術(shù)只設(shè)計(jì)一種磁珠類(lèi)型（尾部為C，從而與待測(cè)位點(diǎn)的前一個(gè)堿基配對(duì)）：與不同甲基化狀態(tài)（非甲基化或甲基化位點(diǎn)）的單堿基雜交，根據(jù)兩種不同熒光信號(hào)計(jì)算位點(diǎn)的甲基化程度。

 

精密度和準(zhǔn)確度:

Infinium Methylation EPIC甲基化芯片在不同重復(fù)間顯示出很強(qiáng)的相關(guān)性（R² >0.98），與Infinium Human Methylation 450K芯片也有很強(qiáng)的重復(fù)性（R² >0.98）（圖6A、6B），與全基因組甲基化測(cè)序也有很強(qiáng)的重復(fù)性（圖6C）。

圖6  Infinium技術(shù)具有較高的重復(fù)性和測(cè)序數(shù)據(jù)較高的相關(guān)性。 A. 在非腫瘤組織不同重復(fù)間顯示出很強(qiáng)的相關(guān)性（R² >0.98）。B. 850K芯片和450K芯片之間也有很強(qiáng)的重復(fù)性（R² >0.98）。C. 在正常組織和腫瘤肺組織相比于全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)有很強(qiáng)的相關(guān)性。

 

分析靈敏度：

通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)重復(fù)的結(jié)果（8個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品），已經(jīng)證明Infinium Methylation EPIC甲基化芯片可靠地檢測(cè)0.2的delta-beta值，低于1%的假陽(yáng)性率。

 

內(nèi)部質(zhì)量控制：

Infinium HD檢測(cè)產(chǎn)生高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，具有樣本依賴(lài)和樣品不依賴(lài)的對(duì)照，例如Infinium Methylation EPIC甲基化芯片配有專(zhuān)為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后序列復(fù)雜度降低而設(shè)計(jì)的負(fù)對(duì)照。

 

高應(yīng)用兼容性：

Infinium產(chǎn)生的甲基化數(shù)據(jù)很容易與Illumina公司其它平臺(tái)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)兼容，例如基因表達(dá)譜分析，這使得研究人員能夠?qū)虮磉_(dá)數(shù)據(jù)和Infinium甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。

 

適用于FFPE樣品的甲基化研究：

Infinium Methylation EPIC甲基化芯片改進(jìn)版的protocol適用于FFPE樣本的甲基化研究，利用Infinium FFPE DNA修復(fù)方案可以獲得可靠可重復(fù)的結(jié)果（表2）。

表1. Infinium Methylation EPIC甲基化芯片檢測(cè)正常樣本和FFPE樣本時(shí)的數(shù)據(jù)對(duì)比。 與正常樣本相比，F(xiàn)FPE樣本的位點(diǎn)檢出率大于90%，不同重復(fù)間顯示出很強(qiáng)的相關(guān)性（R² 大于0.98）。

 

技術(shù)參數(shù)與實(shí)驗(yàn)流程

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技術(shù)參數(shù)

樣本要求	檢測(cè)策略	其它說(shuō)明
·             樣品類(lèi)型：基因組DNA ·             樣品需求量：總量>2μg；濃度≥50ng/μL ·             樣品質(zhì)量：260/280介于1.7-2.0之間 ·             樣品運(yùn)輸：DNA低溫運(yùn)輸（-20℃） ·             樣本無(wú)明顯降解，無(wú)污染	·             芯片雜交	·             可檢測(cè)FFPE樣本 ·             使用Infinium技術(shù)，無(wú)其它甲基化DNA捕獲方法常有的偏向性

 

實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)分析流程

A.         實(shí)驗(yàn)流程

B.          數(shù)據(jù)分析流程

 

甲基化芯片完成以后做點(diǎn)什么呢？

l  全基因組850K芯片篩選；

l  通過(guò)β值篩選甲基化差異顯著位點(diǎn)；

l  篩選甲基化差異區(qū)域（DMR）；

l  綜合生物學(xué)意義和差異甲基化區(qū)域，選擇目的區(qū)域和目的基因；

l  利用MethylTarget技術(shù)在大樣本中檢測(cè)這些顯著差異位點(diǎn)的甲基化水平；

 

天昊生物在提供全基因組甲基化芯片服務(wù)的同時(shí)，還提供候選基因甲基化水平的定量或定性檢測(cè)。我們根據(jù)客戶(hù)提供的候選基因（來(lái)自文獻(xiàn)、甲基化芯片、表達(dá)譜芯片或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)），針對(duì)其啟動(dòng)子/CpG島/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域等區(qū)域進(jìn)行甲基化檢測(cè)。

l  通過(guò)文獻(xiàn)、甲基化芯片或表達(dá)譜芯片或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的方法篩選目的基因；

l  通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件尋找候選基因的CpG區(qū)域；

l  利用MethylTarget技術(shù)對(duì)候選CpG位點(diǎn)進(jìn)行定量檢測(cè)；

 

關(guān)于天昊：

天昊生物秉承"創(chuàng)新基因科技，成就科學(xué)夢(mèng)想"的核心理念，目前形成了全基因甲基化測(cè)序/全基因組850K甲基化芯片檢測(cè)/目的區(qū)域富集甲基化檢測(cè)/DNA甲基化克隆測(cè)序全面的整體解決方案，目前天昊生物通過(guò)自主創(chuàng)新，獨(dú)立研發(fā)了高通量高靈敏度目的區(qū)域富集甲基化水平檢測(cè)技術(shù)MethylTarget^TM，目前天昊生物在甲基化定量檢測(cè)領(lǐng)域處于絕對(duì)領(lǐng)先位置，天昊生物希望憑借自身積累的豐富經(jīng)驗(yàn)，為廣大客戶(hù)提供最好最優(yōu)質(zhì)的甲基化檢測(cè)服務(wù)。