天昊生物客戶發(fā)表CO2改變淡水生態(tài)系統(tǒng)中微微型浮游植物群落結(jié)構(gòu)的文章

發(fā)稿時間：2017-01-20來源：天昊生物

中國科學(xué)院地理與湖泊研究所史小麗課題組，近期在《Fundamental and Applied Limnology》上發(fā)表了CO₂改變淡水生態(tài)系統(tǒng)中微微型浮游植物群落結(jié)構(gòu)的文章。在這項研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的擴增子測序工作和生物信息學(xué)分析。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：CO₂ alters picophytoplankton community structure in fresh water ecosystems

中文題目：CO₂改變淡水生態(tài)系統(tǒng)中微微型浮游植物群落結(jié)構(gòu)

期刊名：Fundamental and Applied Limnology      發(fā)表時間： 2016年11月

研究背景: 大氣CO₂濃度從工業(yè)化前的280 ppm增加到現(xiàn)在的400 ppm，預(yù)計到下一世紀(jì)將翻一番，達到750 ppm。最近研究指出，60%富營養(yǎng)化湖泊的CO₂是不飽和的，富營養(yǎng)和碳限制在淡水系統(tǒng)是很常見的。由于地球上的大多數(shù)湖泊很淺且易受水運動影響，這就決定了空氣和水之間CO₂的流動。因此，大氣CO₂濃度增加可能對這些富營養(yǎng)化的淡水生態(tài)系統(tǒng)有重要影響。微微型浮游植物（小于3μm）包括picocyanobacteria和photosynthetic picoeukaryotes(PPEs)，它們分布廣泛，并且在許多湖泊和海洋碳循環(huán)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們分別在淡水和海洋系統(tǒng)中可以占到總?碳?生產(chǎn)的16% - 70%和1?%- 90 %。?但是目前關(guān)于這些微微型浮游植物對CO₂變化的響應(yīng)以及這些響應(yīng)對整個生態(tài)系統(tǒng)的作用仍然是未知的。

研究目的:調(diào)查 CO₂濃度升高如何改變微微型浮游植物的群落結(jié)構(gòu)以及具體哪個微微型浮游植物物種對CO₂濃度升高是敏感的

 

技術(shù)：18S rRNA擴增子測序，V4區(qū)

測序平臺：Illumina MiSeq測序平臺

實驗設(shè)計：

實驗在東湖太湖生態(tài)?站?進行。湖水通過100μ米孔徑的尼龍篩去除大浮游動物和碎片，然后被泵入九個白色塑料容器中（200升）。容器放置在東湖生態(tài)站的人工池塘中來模擬當(dāng)?shù)氐臏囟群凸庹账?。每天向容器中補充定量的溶解性營養(yǎng)（KH₂PO₄，NH₄Cl，NaNO₃），使之保持在一個穩(wěn)定的水平，以避免營養(yǎng)的影響，從而集中觀測CO₂處理的影響。分別進行三種不同CO₂水平的處理：270 ppm，380 ppm和750 ppm，從而分別模仿工業(yè)化前，當(dāng)前和未來（2100年）的CO₂濃度。每個處理有3個生物學(xué)重復(fù)。使用相同的實驗系統(tǒng)進行了四次獨立觀測：分別在2013年8月（夏季），2013年11月（秋季），2014年1月（冬季），2014年4月（春季），從而比較在這4個不同季節(jié)微微型浮游植物對CO₂變化的響應(yīng)。

理化參數(shù)：

每天使用水質(zhì)分析儀測定硝態(tài)氮（NO₃^?–），銨（NH₄⁺）和磷酸鹽（PO₄^3?–）濃度。每天補充各養(yǎng)分以確保容器和湖之間的營養(yǎng)水平一致，現(xiàn)場使用多參數(shù)測量儀測定水溫，溶解氧（DO），pH值和電導(dǎo)率。每3天水樣品在上午8:00-10:00運到岸邊實驗室被立即預(yù)處理，被過濾得到的水次級樣品立即用來測定葉綠素a（Chl-a）和堿度（ALK）。水中的pCO2根據(jù)pH值和堿度（ALK）進行估計。

葉綠素a含量分析：

通過熒光分光光度法測定葉綠素a含量來估計浮游植物生物量。每個容器100?–?200?毫升水次級樣本通過3μm Millipore濾膜過濾兩次，然后再經(jīng)過0.2μM Millipore濾膜過濾。分別對通過3μm和0.2μM膜過濾得到的大型浮游植物和微微型浮游植物進行葉綠素a含量測量。

DNA提取和18S rRNA擴增子測序：

使用DNeasy Blood and Tissue Extraction Kit (Qiagen)提取hotosynthetic picoeukaryotes (PPEs)DNA。使用真核生物V4區(qū)進行18S rRNA擴增子測序。

研究結(jié)果：

化學(xué)環(huán)境

實驗容器中的可溶性營養(yǎng)物質(zhì)濃度與附近的湖是相似的。硝態(tài)氮是主要的溶解態(tài)氮組分。銨濃度最高是在春天，達到0.12毫克/升（表1）。磷酸鹽濃度在0.075毫克/升-0.17毫克/升變化（表1）。

不同水平CO2處理引起實驗容器中水溶解CO₂濃度的變化，低濃度CO₂處理導(dǎo)致水溶解CO₂濃度也相對較低（圖1a）。pH值的季節(jié)性變化也較大，秋季最低為6.7，夏天最高為9.8，水溶解CO₂濃度升高會導(dǎo)致所有季節(jié)水pH值下降（秋季除外）。

表1四個不同季節(jié)容器內(nèi)養(yǎng)分的濃度測定

圖1 四個季節(jié)中不同濃度CO₂處理下水樣本pH值和溶解性CO₂濃度

微微型浮游植物豐度

微微型浮游植物對浮游植物葉綠素生物總量的貢獻在不同季節(jié)之間差異很大，夏季最低達到18%，冬季最高為79%，然而不同濃度CO2處理之間微微型浮游植物對浮游植物葉綠素生物總量的貢獻卻沒有差異（表2）。

表2 微微型浮游植物對浮游植物葉綠素生物總量的貢獻百分比

通過流式細胞儀對兩種微微型浮游植物進行鑒定：一組是Phycocyanin-rich picocyanobacteria，它具有豐富的藻藍蛋白，是由PC細胞構(gòu)成；另一組是photosynthetic picoeukaryotes (PPEs)，則含有豐富的葉綠素a（圖2）。

圖2微微型浮游植物的流式細胞分布。暗紅色熒光：Phycocyanin-rich picocyanobacteria富含藻藍蛋白；紅色熒光：PPE富含葉綠素a

通過流式細胞技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在春天，PC細胞經(jīng)歷了爆炸性增長，密度從24×10³個細胞/微升漲至1280×10^3?細胞/微升（圖3a）。在夏天，第21天達到頂峰，密度達到1000×10^3?細胞/微升（圖3b）。在秋天，PC細胞只有在最后一天才表現(xiàn)出明顯的增長（圖3c）。在冬天，PC細胞的濃度太低沒有被檢測到。

在春季和秋季，PPES濃度在結(jié)束階段表現(xiàn)出持續(xù)的增長（圖3d，3f）。在夏季的早期階段，PPES濃度迅速增加，在第6天達到最大值，然后下降（圖3e）。總體來說，春季PPEs含量最高，冬季PPEs含量最低（圖3g）。在春季試驗后期，PPEs的細胞密度在高濃度CO₂處理下顯著較高（圖3d）,而在冬季，PPEs的細胞密度在高濃度CO₂處理下則顯著較低。

圖3 四個季節(jié)中不同濃度CO₂處理下PC細胞與PPES濃度的變化

PPEs群落組成

首先通過流式細胞技術(shù)將PPEs分選出來，然后通過18SrDNA擴增子測序技術(shù)對春季和冬季不同濃度CO₂處理下的PPEs群落結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPEs的162個OTUs可以歸類為Cryptophyta（隱藻門）, Haptophyta（定鞭藻門）, Stramenopiles（不等鞭毛門）, Chlorophyta（綠藻門）等。其中，Chlorophyta（綠藻綱）和Chrysophyceae（金藻綱）占總序列數(shù)的比例居多，大約占30%（圖4）。春季和冬季PPEs的群落結(jié)構(gòu)主要差異是：Bacillariophyceae（硅藻綱）只在春天可以發(fā)現(xiàn)（圖4）。

圖4 春季和冬季PPEs的群落結(jié)構(gòu)

PPEs的群落組成在春季和冬季非常相似，有100個共有的OTUs，分別有30個OTUs不同（圖5）。在春季，3個不同濃度CO₂處理共有78個OTUs，一個金藻綱OTU顯示對CO₂濃度變化十分靈敏（表4），其比例隨著CO₂濃度上升而減少。在冬季，3個不同濃度CO₂處理共有55個OTUs（圖5），一個衣藻屬OTU，其比例隨著CO₂濃度上升而減少（表4）。2個隱藻門OTU比例隨著CO₂濃度上升而減少。2個金藻綱OTU比例隨著CO₂濃度上升而上升（表4）。

表4   不同濃度CO₂處理下豐度有差異的OTU

圖5 不同季節(jié)或不同濃度CO2處理下的OTUs韋恩圖分析

總結(jié)：

1.         微微型浮游植物占東太湖浮游植物的主要部分，它們的葉綠素a含量最多貢獻了冬季葉綠素a總量的79%。

2.         Phycocyanin-rich picocyanobacteria（PC細胞）占東太湖微微型浮游植物群落的主要部分（冬季除外）。

3.         PC細胞濃度對CO₂濃度的改變不敏感；與此相反，在春季，CO₂濃度升高能顯著增加photosynthetic picoeukaryotes (PPEs)的豐度，但是在冬季則降低了PPEs的豐度。

4.         使用18SrDNA擴增子測序?qū)Υ杭竞投静煌瑵舛菴O₂處理下PPEs樣品進行群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明Chlamydomonas（衣藻綱）和Cryptophyceae（隱藻綱）不受高濃度CO₂處理青睞，其比例隨著CO₂濃度上升而減少；而Chrysophyceae（金藻綱）則受惠于CO₂濃度增長，其比例隨著CO₂濃度上升而增加。

 

關(guān)于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250測序策略對細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進行測序，使用低循環(huán)數(shù)擴增，保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內(nèi)誤差；數(shù)據(jù)質(zhì)量高，有效序列Q30達到80%以上；加上最新升級的分析內(nèi)容和解釋詳盡的結(jié)題報告，帶您享受極致的微生物擴增子測序體驗。