天昊生物客戶在《Frontiers in Microbiology》上發(fā)表不同施肥制度對(duì)叢枝菌根真菌（AMF）群落組成影響的文章

發(fā)稿時(shí)間：2016-12-12來源：天昊生物

      南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院凌寧教授課題組近期在《Frontiers in Microbiology》上發(fā)表了施肥制度對(duì)叢枝菌根真菌（AMF）群落組成的影響與玉米根際土壤中的有機(jī)質(zhì)組成相關(guān)的文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的擴(kuò)增子測(cè)序工作和生物信息學(xué)分析。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Impacts of Fertilization Regimes onArbuscularMycorrhizal Fungal (AMF)Community Composition WereCorrelated with Organic MatterComposition in Maize RhizosphereSoil

中文題目：施肥制度對(duì)叢枝菌根真菌（AMF）群落組成的影響與玉米根際土壤中的有機(jī)質(zhì)組成相關(guān)

期刊名：Frontiers in Microbiology發(fā)表時(shí)間： 2016年11月影響因子：4.165

技術(shù)：18S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序，AMV4.5NF–00引物

測(cè)序平臺(tái)：IlluminaMiSeq測(cè)序平臺(tái)

實(shí)驗(yàn)描述

田間施肥試驗(yàn)于2013年在黑龍江省農(nóng)科院的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范站實(shí)施。這個(gè)地區(qū)有典型的季風(fēng)氣候，年平均3.6^?C和486.4–543.6毫米降雨量。種植制度主要是一年一次玉米作物。有四個(gè)實(shí)驗(yàn)處理：（1）NK，只施加氮和鉀肥；（2）NPK，只施加N、P、K肥；（3）NPKM，施加N、P、K和有機(jī)肥；（4）M，只施加有機(jī)肥。每一個(gè)處理在不同的3個(gè)地塊有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

根際土壤采樣與DNA提取

于2014年10月從各處理收集根際土壤樣品，從每一個(gè)地塊隨機(jī)收集五個(gè)玉米植株的根際土壤樣品組成混合樣品。根被大力地震動(dòng)從而分離那些不是緊緊地吸附于根上的土壤，然后，5克含有牢牢吸附土壤的植物根際溶于30毫升蒸餾水，并高速渦旋1分鐘。蒸餾水中的土壤作為根際土壤用于后續(xù)分析。真空冷凍干燥后，一部分被保存在4^?C 用于GC–MS分析，而另一部分被存儲(chǔ)在?80^?C用于DNA提取。每個(gè)肥料處理的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)根際樣品用于DNA提取。使用PowerSoil DNA Isolation Kit(Mo Bio)提取0.25克凍干土壤的總DNA。

根際土壤溶解有機(jī)物提取和GC–MS分析

乙酸乙酯提取的溶解有機(jī)物（DOM）用于GC–MS分析。由于土壤溶解有機(jī)物DOM的高多樣性，乙酸乙酯提取的溶解有機(jī)物（DOM）不包含所有復(fù)雜的土壤有機(jī)質(zhì)，但它能全面闡述溶解有機(jī)物（DOM）中的所有可能的分子類別。每個(gè)土壤樣品（0.5克）和5毫升乙酸乙酯添加到離心管。30?C 170轉(zhuǎn)搖1小時(shí)，該懸浮液被過濾（0.45毫米）到一個(gè)干凈的離心管，35?C真空濃縮至0.5毫升，濃縮樣品被存儲(chǔ)用于GC–MS分析。

研究背景:肥料應(yīng)用的增加提出了一個(gè)問題：富營養(yǎng)化的土壤對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生什么影響。一些研究表明，平衡施肥，包括補(bǔ)充氮（N），磷（P）和鉀（K），改變了土壤微生物群落和增強(qiáng)了土壤微生物的有效代謝因?yàn)榭衫脿I養(yǎng)的增加，在多數(shù)情況下，這會(huì)導(dǎo)致土壤生產(chǎn)力的提高，但是過量和不適當(dāng)?shù)幕适┯脮?huì)造成了一系列環(huán)境問題和土壤退化。與化學(xué)施肥相比，對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)施加有機(jī)肥料常被用來增加土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）的含量，用來改變了土壤物理、化學(xué)和生物性質(zhì)，因此提高了作物產(chǎn)量。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，因非常有必要了解有機(jī)或無機(jī)肥施用對(duì)土壤微生物群落的影響。例如，土壤真菌多樣性被認(rèn)為是一個(gè)很好的和靈敏的土壤肥力指標(biāo)。叢枝菌根真菌（AMF）是一類重要的土壤微生物群，它能調(diào)節(jié)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的多種功能。

叢枝菌根真菌是古老的根共生生物，它們的第一次出現(xiàn)與陸生植物的出現(xiàn)相吻合。叢枝菌根真菌（AMF）與80%的陸生植物物種的根形成共生體系，叢枝菌根真菌從植物體內(nèi)獲取必要的碳水化合物及其他營養(yǎng)物質(zhì)，而植物也從真菌那里得到所需的營養(yǎng)及水分等，因此AMF在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，土壤對(duì)某些營養(yǎng)素的需求可通過AMF群落組成或多樣性的變化反映出來，然而，人類活動(dòng)如何驅(qū)動(dòng)AMF群落變化仍然是未知的。所有AMF都屬于球囊菌門，而且大多數(shù)是專性共生，是不能單獨(dú)培養(yǎng)的。因此AMF類群的鑒定不能依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。在這項(xiàng)研究中，我們使用擴(kuò)增子測(cè)序調(diào)查不同施肥制度對(duì)玉米根際土壤AMF群落組成和多樣性的影響。

研究結(jié)果：

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和優(yōu)化，得到1214071條有效序列，占主導(dǎo)地位的長度分布為大約221-240 bp。通過和SILVA數(shù)據(jù)庫比對(duì)，得到了很多非球囊菌門得序列，總體而言，使用引物對(duì)AMV4.5NF/AMDGR只得到了165805條球囊菌門序列（占總數(shù)的13.5%），其它主要真菌類別是壺菌門、Basidiomycota,、Zygomycota,、Ascomycota、Blastocladiomycota（表1）。

表1 使用引物對(duì)AMV4.5NF/AMDGR只得到土壤樣品中的每個(gè)真菌門序列的比例分布

施肥對(duì)AMF群落a多樣性的影響

與其它處理相比，施加有機(jī)肥（M）能顯著增加AMF群落OTUs的數(shù)量（圖S1）。計(jì)算了每個(gè)樣本的Shannon 指數(shù)和ACE指數(shù)（圖1）。施加有機(jī)肥（M）土壤中的ACE指數(shù)顯著較高。

圖S1  樣品的稀釋性曲線

圖1 不同處理樣品的Shannon 指數(shù)和ACE指數(shù)

施肥對(duì)AMF群落組成的影響

在不同處理中，AMF群落組成變化很明顯。第一主成分能解釋AMF群落變化的62.22%，能把是否施加有機(jī)肥的群落明顯分開（圖2）。Adonis分析結(jié)果表明，不施加有機(jī)肥（?M）的組別，包括NK和NPK，與有機(jī)肥處理（+M）組別，包括NPKM和M，在群落水平上有顯著差異(R²=0.41559, P = 0.003)（表S1），因此，我們把4個(gè)處理分為兩組（?M和+M）用于隨后的分析。

圖2 不同處理AMF菌落的RDA分析

表S1不施加有機(jī)肥（?M）與施加有機(jī)肥（+M）組別的AMF菌落結(jié)構(gòu)差異

同時(shí)，施用有機(jī)肥是帶來玉米根際AMF群落組成變化的第一關(guān)鍵因素（R²= 0.7695，P= 0.002）（表S2），第二大影響因素是N肥（R²=0.6472、D P 0.022），其次是磷肥（R²=0.5048，P =0.04）。

表S2AMF菌落結(jié)構(gòu)RDA的蒙特卡洛置換檢驗(yàn)

乙酸乙酯提取的溶解有機(jī)物（DOM）和AMF群落組成之間的關(guān)系

Mantel檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)根際土壤的乙酸乙酯提取溶解有機(jī)物與AMF群落顯著相關(guān)。GC–MS共鑒定了59個(gè)有機(jī)化合物，其中11個(gè)有機(jī)化合物被確定與AMF群落相關(guān)，11個(gè)相關(guān)分子中大部分是長鏈烷烴和苯。同時(shí)硬脂酸和3-(2, 6, 6-trimethyl-1-cyclohexene-1-yl) allylalcohol在NPKM處理土壤中沒有被檢測(cè)到，而1、4-dimethylnaphthalene只是在NK處理土壤中被檢測(cè)到，然而，2-ethylnaphthalene在NK處理土壤中沒有被檢測(cè)到。此外，十八烷和二十六烷在有機(jī)肥處理組別(M、NPKM) 都沒有檢測(cè)到，但是在無機(jī)肥處理組別 (NK、NPK)（M、NPKM）都檢測(cè)到了，這表明不同類別肥料處理通過改變有機(jī)成分推動(dòng)了AMF群落的變化。

乙酸乙酯提取溶解有機(jī)物與AMF群落屬的皮爾森相關(guān)性分析表明兩類有機(jī)化合物與 球囊霉屬負(fù)相關(guān)，而一類有機(jī)化合物與Rhizophagus正相關(guān)（圖4）。

圖4 乙酸乙酯提取溶解有機(jī)物與AMF群落屬的皮爾森相關(guān)性分析

有機(jī)肥料處理和無機(jī)肥料處理的AMF群落網(wǎng)絡(luò)圖差異

基于上述結(jié)果，我們把4個(gè)土壤處理劃分為兩個(gè)處理(+M和-M)。因此，我們用這兩個(gè)處理用于網(wǎng)絡(luò)分析。如圖5所示，有機(jī)肥料處理(NPKM、M)和無機(jī)肥料處理(NK、NPK)的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果是有顯著差異的。在無機(jī)肥料處理 (?M)中，網(wǎng)絡(luò)有36個(gè)節(jié)點(diǎn)和80個(gè)邊緣，4個(gè)群落的模塊化為0.540。在有機(jī)肥料處理 (+M)中，網(wǎng)絡(luò)有35個(gè)節(jié)點(diǎn)和86個(gè)邊緣，5個(gè)群落的模塊化為0.438（圖5）。我們定義有七個(gè)以上邊緣的節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中心，有機(jī)肥料處理 (+M)網(wǎng)絡(luò)中心的數(shù)量多于無機(jī)肥料處理 (?M)，這表明有機(jī)肥料處理 (+M)有更多活躍的物種在AMF群落中與其他物種存在相互作用。所有的網(wǎng)絡(luò)中心都被歸類為球囊霉目。同時(shí)，兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)共享3個(gè)網(wǎng)絡(luò)中心，包括OTU9，OTU31和OTU217。這個(gè)三類OTUs屬于進(jìn)化樹的不同分支（圖6），OTU9和OTU 217屬于球囊霉屬，而OTU31屬于近明球囊霉。

圖5無機(jī)肥料處理 (?M)和有機(jī)肥料處理 (+M)AMF群落的網(wǎng)絡(luò)圖分析

圖6 兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖分析得到的所有OTUs序列的進(jìn)化樹分析

總結(jié)：

?  在玉米根際AMF真菌多樣性被不同施肥制度顯著改變。

?  施用有機(jī)肥是帶來玉米根際AMF群落組成變化的第一關(guān)鍵因素，第二大影響因素是N肥，其次是磷肥。

?  GC–MS測(cè)定發(fā)現(xiàn)施加有機(jī)肥能顯著改變玉米根際的有機(jī)質(zhì)組成，皮爾森相關(guān)性分析表明兩類有機(jī)化合物與球囊霉屬負(fù)相關(guān)，而一類有機(jī)化合物與Rhizophagus正相關(guān)。

?  有機(jī)肥料處理和無機(jī)肥料處理的AMF群落網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果是有顯著差異的，有機(jī)肥料處理網(wǎng)絡(luò)中心的數(shù)量多于無機(jī)肥料處理。兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)共享3個(gè)網(wǎng)絡(luò)中心，這三類OTUs都被歸類為球囊霉目。

?  綜上所述，不同施肥模式對(duì)AMF群落的影響于玉米根際土壤中有機(jī)質(zhì)組成相關(guān)，而施用有機(jī)肥能激活更多的AMF物種與其他玉米根際的物種相互作用。這為調(diào)節(jié)植物和真菌的共生系統(tǒng)，維護(hù)作物的高產(chǎn)量和健康生長，并為合理施肥提供了初步依據(jù)。

關(guān)于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250測(cè)序策略對(duì)細(xì)菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進(jìn)行測(cè)序，使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增，保證每個(gè)樣品擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內(nèi)誤差；數(shù)據(jù)質(zhì)量高，有效序列Q30達(dá)到80%以上；加上最新升級(jí)的分析內(nèi)容和解釋詳盡的結(jié)題報(bào)告，帶您享受極致的微生物擴(kuò)增子測(cè)序體驗(yàn)。