兒童滲出性中耳炎的微生物組成解析

發(fā)稿時間：2016-12-05來源：天昊生物

英文題目：The Microbiome of Otitis Media With Effusion

中文題目：滲出性中耳炎的微生物組成

期刊名：The Laryngoscope       

技術(shù)：擴增子測序，V3-V4區(qū)

發(fā)表時間： 2016 

研究背景

中耳炎（OME）是最常見的兒童聽力損傷的原因。據(jù)統(tǒng)計2歲內(nèi)的小孩有1/5患過中耳炎，而10歲以內(nèi)的小孩有4/5都曾受到中耳炎的影響。盡管咽鼓管在中耳炎中起到重要的作用，但中耳炎的發(fā)病機制還不清楚。通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)分離出的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌是中耳炎最常見的發(fā)病原因。隨著相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，如16SrRNA焦磷酸測序，人們在中耳中檢測到一些以前未知的細菌，其中一種新發(fā)現(xiàn)的發(fā)病菌，如耳炎差異球菌（AO）已經(jīng)從中耳分泌物中檢測出來。

篩選標(biāo)準(zhǔn)

中耳炎患者：具有慢性滲出性中耳炎（＞3個月）做了腺樣體切除術(shù)等待氣管插入的兒童。招募了1-8歲（平均年齡40個月）的23名中耳炎患者（14名男性）。

對照組患者：在過去12個月沒有中耳炎歷史，經(jīng)歷過其他形式的手術(shù)需要全身麻醉，從鼻咽部遠處解剖進行過氣管插管。招募了1-12歲的10名對照患者（平均年齡73個月）。

排除標(biāo)準(zhǔn)

       包括以前的腺樣體切除術(shù)，急性中耳炎，無積液，手術(shù)時上呼吸道感染，手術(shù)前4周服用過抗生素或類固醇。

人口統(tǒng)計數(shù)據(jù)

       包括年齡，性別，和父母吸煙狀況以及臨床資料，包括現(xiàn)在的癥狀、以前的檢測史、用藥史和手術(shù)史。

樣品采集和DNA提取

       中耳積液收集：包括外耳道洗耳器在內(nèi)都是無菌設(shè)備。進行鼓膜切開術(shù)，使用微型吸管吸取積液，然后使用2微升的無菌生理鹽水沖洗。

      腺樣體拭子收集：為了避免污染，所有的拭子直視下取口樣。無菌拭子被引導(dǎo)入口，避免與口咽粘膜接觸。然后將拭子在腺樣體表面刷5次并立即轉(zhuǎn)移到一個內(nèi)旋蓋凍存管。

      所有樣本取樣后立即放在冰上，并轉(zhuǎn)移至-80度冰箱保存。從樣品中抽提細菌DNA 采用PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Salona Beach, CA)。

人口統(tǒng)計數(shù)據(jù)

     收集了35個中耳積液樣品。對照組7名患者通過喉支氣管鏡檢來檢查軟喉癥，其余3名患者分別進行全身麻醉甲狀腺切除術(shù)，耳前竇道修復(fù)和氣道異物檢查。在年齡、性別和處于同一吸煙環(huán)境的單變量分析中，兩組間無顯著性差異。

中耳微生物組

中耳液中的細菌主要是好氧菌，但在患者間的相對豐度差異較大（圖1）。相對豐度最高的是差異球菌屬和耳源屬（莫拉克斯氏菌屬，嗜血桿菌屬和鏈球菌屬）（表I）。

差異球菌屬和嗜血桿菌的相對豐度表現(xiàn)出負相關(guān)（P=.049）。此外，亞組分析表明單側(cè)積液中的差異球菌屬比雙側(cè)積液中的豐度更高（P=.004， U檢驗）。

 

圖1 中耳液中微生物的相對豐度

表1 分泌型中耳炎病人腺樣體拭子和中耳液樣本中的細菌相對豐度和流行度

 中耳內(nèi)不同豐度微生物之間存在相關(guān)性（圖2，表II）?？偟膩碚f，所有的MEF樣本都含有一個核心的厭氧菌屬和兼性厭氧菌屬.

 

圖2 中耳滲出液中細菌之間的關(guān)系圖。紅：厭氧菌；橙：兼性厭氧菌；藍：好氧細菌。

圓的大小是相對于其他細菌的相關(guān)性。

表二  中耳滲出液中細菌之間的相關(guān)性。

 

同一患者的雙側(cè)積液微生物組成基本相同（圖3和圖4），具有雙側(cè)中耳炎的不同患者之間積液微生物組成也基本一致。常見的致病性菌屬間有著較強的相關(guān)性：嗜血桿菌（P=.007），鏈球菌（P <0.001），葡萄球菌（P =.025）和棒狀桿菌（P =.006）。

圖3 不同中耳液樣品相似性的聚類分析

圖4 雙側(cè)中耳滲出液微生物組成的相對豐度

腺體微生物組與中耳微生物組

中耳腔中的微生物組成和腺體的微生物組成不同，但是來自中耳炎患者和對照組的腺樣體拭子間的 Alpha 多樣性類似（圖5，表I）。豐度最高的17個細菌屬中有13個在中耳液和腺體之間存在豐度差異，另外有三個細菌屬（假單胞菌，腸桿菌和彎曲桿菌）只出現(xiàn)在中耳液樣本中（表1）。這些結(jié)果是通過進行β多樣性檢查的PERMANOVA多變量分析和Co-occurrence模型得到的（圖6）。

 

           圖5  微生物種屬水平基于Bray-Curtis的PCA分析

圖6  Co-occurrence model模型顯示不同樣本類型種屬水平的相對豐度

中耳炎患者腺體微生物組與對照組微生物

中耳炎患者和對照組的腺體樣本在微生物多樣性和相對豐度方面類似（表III）。PERMANOVA分析再次證實了這相似性。中耳炎患者腺體樣本中引起中耳病的細菌（鏈球菌屬，嗜血桿菌屬和莫拉克斯氏菌屬）豐度更高。此外，相同的厭氧和兼性厭氧菌在中耳炎患者中的豐度高度相關(guān)，這一現(xiàn)象在腺體中也是一致的。

 

結(jié)果總結(jié)

1.   中耳液中的細菌主要是好氧菌，相對豐度最高的是差異球菌屬和耳源屬（莫拉克斯氏菌屬，嗜血桿菌屬和鏈球菌屬）。

2.   差異球菌屬和嗜血桿菌的相對豐度表現(xiàn)出負相關(guān)。此外，單側(cè)積液中的差異球菌屬比雙側(cè)積液中的豐度更高。

3.   同一患者的雙側(cè)積液微生物組成基本相同，具有雙側(cè)中耳炎的不同患者之間積液微生物組成也基本一致。

4.   中耳腔中的微生物組成和腺體的微生物組成不同。中耳炎患者和對照組的腺體樣本在微生物多樣性和相對豐度方面類似。

5.   腺體樣本和中耳腔的微生物群之間的差異表明：腺樣墊是兒童中耳炎患者中耳積液的一個重要儲層。在兒童中耳炎患者中，中耳的微環(huán)境對微生物的組成比由腺體傳播到中耳的潛在致病菌起著更大作用。

關(guān)于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250測序策略對細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18SrDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進行測序，使用低循環(huán)數(shù)擴增，保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內(nèi)誤差；數(shù)據(jù)質(zhì)量高，有效序列Q30達到80%以上；加上最新升級的分析內(nèi)容和解釋詳盡的結(jié)題報告，帶您享受極致的微生物擴增子測序體驗。