人體宏基因組測(cè)序，要玩咱就玩最經(jīng)典的策略！

發(fā)稿時(shí)間：2016-11-25來(lái)源：天昊生物

      目前的微生態(tài)研究分為微生態(tài)與健康、微生態(tài)與環(huán)境、微生態(tài)與農(nóng)牧三個(gè)方向。從大型微生物組的研究領(lǐng)域來(lái)看，人類微生物組所占比例最大， 按照微生物群在人微生態(tài)系統(tǒng)中的空間不同可以把人體微生態(tài)系統(tǒng)分為以下幾類：胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)、口腔微生態(tài)系統(tǒng)、生殖道微生態(tài)系統(tǒng)、皮膚微生態(tài)系統(tǒng)、呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)。近年來(lái)，宏基因組測(cè)序?yàn)槿梭w微生態(tài)研究提供新的方向和內(nèi)容，下面我們分別根據(jù)樣本量大小總結(jié)了目前最經(jīng)典也是最廣泛使用的組間宏基因組測(cè)序研究策略。

研究策略：組間宏基因組學(xué)

組間宏基因組學(xué)案例1：大樣本量

英文題目：Alterations of human gut microbiome in liver cirrhosis

中文題目：肝硬化中腸道菌群的改變

期刊名：Nature       發(fā)表時(shí)間： 2014         IF：38.138 

一、材料方法

研究材料：收集了中國(guó)漢族123例肝硬化患者和114個(gè)健康人糞便樣本，其中實(shí)驗(yàn)階段98 個(gè)肝硬化患者及 83 個(gè)健康人的糞便樣本；驗(yàn)證階段收集了 31個(gè)健康人和25個(gè)肝硬化患者的糞便樣本

技術(shù)方法：Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)（PE100），平均每個(gè)樣本4.75GB數(shù)據(jù)量

分析內(nèi)容：數(shù)據(jù)質(zhì)控、序列拼接組裝、基因集構(gòu)建、群落結(jié)構(gòu)組成差異分析、基因豐度分析、MGS分析、組間功能和通路差異分析、疾病診斷模型建立

二、研究結(jié)果：

1.腸道菌群基因集構(gòu)建

通過(guò)序列組裝，基因預(yù)測(cè)，建立了肝硬化腸道菌群基因集，包含269萬(wàn)個(gè)非冗余基因，其中36.1%為首次發(fā)現(xiàn)的基因。和歐洲人（MetaHIT）、美國(guó)人（HMP）、中國(guó)糖尿?。═2D）三個(gè)基因集進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有674131個(gè)基因是四個(gè)基因集所共有的，而79萬(wàn)個(gè)基因是肝病基因集所特有的。

圖1. 四個(gè)人類主要微生物基因集的韋恩圖

2.肝硬化病人與健康人的菌落結(jié)構(gòu)差異分析

在不同分類水平上（門(mén)、屬、種）的對(duì)肝硬化病人與健康人的物種豐度差異進(jìn)行分析，例如在門(mén)水平上，肝硬化病人和健康人中，擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)均為優(yōu)勢(shì)菌，相比于健康人，肝硬化病人中的擬桿菌門(mén)豐度低（圖2a），但是變形菌門(mén)和梭菌門(mén)豐度高（圖2b）。

圖2. 肝硬化病人和健康人在不同分類水平上的物種豐度差異。相對(duì)于健康人，在門(mén)、屬、種水平上肝硬化病人豐度減少的物種（a）和豐度增加的物種（b）

3.發(fā)現(xiàn)和肝硬化密切相關(guān)的細(xì)菌：

根據(jù)基因豐度差異，找到肝硬化病人和健康人間顯著差異的基因，利用層次聚類，聚類成豐度一致的基因群，從而找到與肝硬化相關(guān)的（MGS）標(biāo)記菌種，得到了66個(gè)MGS（物種），其中38個(gè)細(xì)菌在健康人中富集，28 個(gè)細(xì)菌在肝硬化病人中富集。

 

圖3. 分別在肝硬化病人和健康人中富集的MGS

4. 肝硬化病人和健康人功能和通路差異：eggNOG功能注釋發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于健康人，肝硬化病人在翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和合成等功能富集的基因更多；KEGG通路注釋發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于健康人，肝硬化病人在跨膜運(yùn)輸通路富集的基因更多。

圖4. 肝硬化病人和健康人功能和信號(hào)通路差異

5.建立識(shí)別肝硬化病人的的診斷模型：基于mRMR 方法到15 個(gè)高特異性和靈敏性的微生物基因標(biāo)記物，提出了診斷肝硬化疾病的模型（PDI）（圖a）；實(shí)驗(yàn)階段和驗(yàn)證階段的AUC值分別為0.918和0.838，表明此模型很準(zhǔn)確（圖b.c）；接著在獨(dú)立驗(yàn)證樣本中對(duì)PDI辨別肝硬化的能力進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠利用此模型有效鑒定肝硬化患者（圖d）。

圖5. 基于標(biāo)記基因物建立疾病診斷模型，該模型能有效辨別肝硬化病人和健康人

比較宏基因組案例2：小樣本量

英文題目：In silico analyses of metagenomes from human atherosclerotic plaque samples

中文題目：人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣本的宏基因組學(xué)分析

期刊名： Microbiome    發(fā)表時(shí)間： 2015            IF：9

一、材料方法

研究材料：（1）有癥狀的不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（case）：是從15例由于近期經(jīng)受短暫腦缺血或輕微中風(fēng)患者的頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)中獲得的。（2）無(wú)癥狀的穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（control）：是從7個(gè)患者的尸檢中獲得，這組患者的死因與心血管疾病無(wú)關(guān)。取3–5毫米厚的組織，立即儲(chǔ)存于?80 °C。

技術(shù)方法：： Illumina HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)（PE100）

分析內(nèi)容：測(cè)序數(shù)據(jù)處理、Alpha多樣性指數(shù)分析、Beta多樣性分析、群落結(jié)構(gòu)組成差異分析、組間功能和通路差異分析

二、研究結(jié)果：

1. 測(cè)序數(shù)據(jù)處理：所有22個(gè)動(dòng)脈斑塊樣品共產(chǎn)生2610268774條reads，然后把這些序列和人類Hg19基因組比對(duì)，沒(méi)有比對(duì)上Hg19基因組的reads平均數(shù)是884727044（每個(gè)樣本平均有33.89%）。然后將這些non-hg19 reads與NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。

2. Alpha多樣性指數(shù)分析：從多樣性指數(shù)分析（表1），稀釋性曲線（圖1）明顯可以看出22個(gè)樣本中有2個(gè)樣本（樣本233 和 238）比其它樣本有更多的物種數(shù)。

圖1：22個(gè)樣品（不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品）的物種稀釋性曲線

表1：多樣性指數(shù)分析

3. Beta多樣性分析： PCoA分析和UPGMA樹(shù)展現(xiàn)不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品分別聚類在一起（圖2）。

圖2：22個(gè)樣品（不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品）的PCoA分析圖和UPGMA樹(shù)。不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣品用白色圓圈表示，7個(gè)穩(wěn)定斑塊樣品（對(duì)照組）用灰色圓圈表示。

4. case/control群落結(jié)構(gòu)組成差異分析：圖3描述了所有22個(gè)樣品屬水平的層次聚類結(jié)果。相比于不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，穩(wěn)定硬化斑塊有更高的宿主微生物豐度，例如紫單胞菌科、鏈球菌科、擬桿菌科、微球菌科。相反的是，相對(duì)于穩(wěn)定斑塊樣品，不穩(wěn)定斑塊樣品有更多病原微生物，如螺旋桿菌科、奈瑟氏球菌科、硫發(fā)菌科。圖4展示了所有樣本中豐度最高的25個(gè)菌種，不穩(wěn)定斑塊樣品中豐度最高的是鼠李糖乳桿菌MTCC 5462，多糖奈瑟球菌ATCC 43768，幽門(mén)螺旋桿菌Hp P-4，并且這些菌的豐度在不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品中存在差異，提示這些菌可能參與促進(jìn)無(wú)癥狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊向有癥狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的轉(zhuǎn)變。

圖3：來(lái)自15例有癥狀動(dòng)脈粥樣硬化性患者（實(shí)驗(yàn)組）的不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和7例死于其它原因患者（對(duì)照組）的穩(wěn)定斑塊的分層聚類結(jié)果。

圖4：所有樣本中豐度最高的25個(gè)菌種，不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣品用白色表示，穩(wěn)定斑塊樣品用灰色表示。

5.case/control的功能和通路差異分析：使用SEED和KEGG對(duì)生物群落進(jìn)行功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)代謝和疾病通路方面不穩(wěn)定斑塊樣品和不穩(wěn)定斑塊樣品之間存在明顯差異（圖5），并且都參與“碳水化合物”、“氨基酸”和“能量”等有關(guān)代謝。另外也參與“心血管疾病“、“循環(huán)系統(tǒng)”、“免疫系統(tǒng)”、“細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡”與“傳染病”等疾病相關(guān)通路。

圖5：使用SEED（a）和KEGG（b）分類對(duì)生物群落進(jìn)行功能分析，不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊樣品用白色表示，穩(wěn)定斑塊樣品用灰色表示。