微生態(tài)研究的日月神劍

發(fā)稿時間：2016-11-23來源：天昊生物

       現(xiàn)行的微生態(tài)研究最常用的兩把利器非擴增子測序和宏基因組測序莫屬，擴增子測序便宜，可以進行物種分類、物種豐度、揭示環(huán)境因子和微生物群落之間的相互關(guān)系，但是不能進行基因預(yù)測及功能注釋。宏基因組測序不但能夠獲得環(huán)境物種組成和豐度信息，還能進行基因預(yù)測及功能注釋，比較樣品間的基因豐度差異和代謝網(wǎng)絡(luò)差異，但是宏基因組測序價格貴，目前最常用的策略就是同時采用擴增子測序和宏基因組測序從而綜合得到兩種技術(shù)的優(yōu)勢結(jié)果。下面我們就總結(jié)一下這種研究策略及它的具體應(yīng)用。

策略：擴增子測序+宏基因組測序

擴增子測序+宏基因組測序案例1：中樣本量

英文題目：Diet shapes the gut microbiome of pigs during nursing and weaning

中文題目：哺乳期及斷奶期不同飲食分別對小豬腸道菌群的影響

期刊名：Microbiome       發(fā)表時間： 2015         IF：9

一、材料方法

研究材料：選擇3頭母豬剛出生的27頭小豬，先母乳喂養(yǎng)21天，在小豬出生后的第1、3、5、7、14、21、28、35和42天用無菌棉拭子收集其糞便樣品，共243個樣本，進行16S擴增子測序 ；出生21天后開始用飼料喂養(yǎng)小豬，每窩選擇1頭小豬，共3頭小豬，分別收集其斷奶前（出生后14日）和斷奶后（出生后35日）的糞便樣品，分別對這6個樣本進行宏基因組測序。

技術(shù)方法：16S擴增子：Illumina Miseq測序平臺（PE250），V4區(qū)；宏基因組：Illumina Miseq測序平臺（PE150）

分析內(nèi)容：α多樣性分析、Beta多樣性分析、群落結(jié)構(gòu)分析、組間功能和通路差異分析、注釋到關(guān)鍵代謝酶上的物種分布

二、研究結(jié)果：

1.α多樣性分析：質(zhì)量控制后，16S 擴增子測序共產(chǎn)生2966033 個reads，平均每個樣本產(chǎn)生13067個reads，α多樣性分析表明斷奶后飼料喂養(yǎng)的小豬腸道微生物多樣性明顯比斷奶前要高（圖1b），從出生到斷奶，微生物多樣性慢慢增加，到斷奶的第21天達(dá)到平臺期（圖1a）。

圖1：不同喂養(yǎng)方式的小豬微生物PD分析（a）和不同喂養(yǎng)天數(shù)的小豬微生物PD分析（b）

2. Beta多樣性分析：PCA分析表明母乳喂養(yǎng)和飼料喂養(yǎng)的小豬腸道菌群結(jié)構(gòu)能明顯分開，說明兩者的差異較大（圖2a）；但是出生后不同天數(shù)小豬的腸道菌群結(jié)構(gòu)則不能明顯分開（圖2b-c）。

圖2.不同喂養(yǎng)方式的小豬微生物PCA分析（a）和不同喂養(yǎng)天數(shù)的小豬微生物PCA分析（b）（圖a藍(lán)色代表母乳喂養(yǎng)樣品，紅色代表飼料喂養(yǎng)樣品）。

3. 群落結(jié)構(gòu)分析：令人驚訝的是，母乳喂養(yǎng)過程中1-21天的微生物群落結(jié)構(gòu)是相對穩(wěn)定的，主要富集在擬桿菌科、梭菌科、毛螺菌科等；斷奶后飼料喂養(yǎng)相對于母乳喂養(yǎng)普雷沃氏菌科增加了50倍，瘤胃菌科和乳桿菌科等顯著增加；而類桿菌科顯著降低（圖3）。同時也找到了母乳喂養(yǎng)過程和飼料喂養(yǎng)過程小豬腸道微生物群落中的主要差異物種（圖4）。

圖3. 不同時間點樣品群落結(jié)構(gòu)組成分析

圖4.兩組樣本間物種差異比較分析

4. 組間功能和通路差異分析：

宏基因組測序平均每個樣本得到497萬個reads，質(zhì)量控制和過濾掉宿主基因組后，進行物種注釋，PCA分析能夠把母乳喂養(yǎng)過程和飼料喂養(yǎng)過程小豬腸道樣本明顯區(qū)分開（圖a）。通過功能注釋發(fā)現(xiàn)，母乳喂養(yǎng)過程和飼料喂養(yǎng)過程小豬腸道菌群在糖代謝方面有顯著差異。母乳喂養(yǎng)的小豬腸道菌群主要富集在乳糖代謝、N-乙酰氨基葡萄糖代謝、半乳糖代謝、唾液酸代謝等過程（圖b）。飼料喂養(yǎng)小豬腸道菌群主要富集淀粉，β-葡聚糖木糖和阿拉伯糖降解酶等過程（圖c）。

圖5.宏基因組測序的6個小豬腸道樣本的PCA分析（a），和參與乳糖代謝（b）和植物多糖代謝（c）的基因豐度比較。

5. 注釋到關(guān)鍵代謝酶上的物種分布：

關(guān)鍵代謝步驟（飲食中糖的代謝）的不同被認(rèn)為與飲食相關(guān)的不同菌群結(jié)構(gòu)的主要原因。例如母乳喂養(yǎng)過程，降解乳糖的主要是唾液酸酶和β-己糖胺酶，參與此過程的以類桿菌屬為主。在飼料喂養(yǎng)過程，參與植物多糖降解的以β-木糖苷酶、內(nèi)-1,4-β-木聚糖酶和α-N-阿拉伯呋喃糖酶為主，參與此過程的菌種更加廣泛，單仍以類桿菌屬為主。

圖6. 斷奶前（a）或斷奶后（b）豬腸道樣本注釋到關(guān)鍵代謝酶上的宏基因組序列物種豐度分布

擴增子測序+宏基因組測序案例2：小樣本量

英文題目：Tongue Coating and the Salivary Microbial Communities Vary in Children with Halitosis

中文題目：舌苔，唾液微生物群落變化與兒童口臭

期刊名：Scientific Reports       發(fā)表時間： 2016         IF：5.228

一、材料方法

研究材料：10個4-5歲健康兒童的舌苔（TH）；10個4-5歲健康兒童的唾液（SH）；10個4-5歲口臭兒童的舌苔（TD）；10個4-5歲口臭兒童的唾液（TH）。40個樣本分別進行16S擴增子測序；4組樣本分別混池，然后對這4個混池樣本進行宏基因組測序。

技術(shù)方法：16S擴增子：454 GS FLX Titanium測序平臺，V1-V3區(qū)；宏基因組：Illumina HiSeq 2500測序平臺（PE150）

分析內(nèi)容：α多樣性分析、群落結(jié)構(gòu)分析、Beta多樣性分析、組間功能和通路差異分析、某通路組間差異分析

二、研究結(jié)果：

1.α多樣性分析：質(zhì)量控制后，16S 擴增子測序共產(chǎn)生394,697個reads，平均每個樣本產(chǎn)生10,387 ± 1,907個reads，平均每個樣本得到66–266 個OTUs。α多樣性分析表明口臭兒童舌苔樣本的物種多樣性明顯高于健康兒童的舌苔樣本（P＜0.05，圖 1A），但口臭兒童和健康兒童的唾液樣本之間物種多樣性則沒有顯著差異（P＞0.05，圖 1B）。

圖1.健康兒童和口臭兒童α多樣性指數(shù)比較分析，健康兒童的舌苔：TH；健康兒童的唾液：SH；口臭兒童的舌苔：TD；口臭兒童的唾液：TH

2. 群落結(jié)構(gòu)分析：8個OTUs相對豐度在口臭兒童舌苔樣本中顯著增高（圖 2A）：其中Leptotrichia wadei (OTU398) 和Peptostreptococcus stomatis (OTU135) 在口臭兒童舌苔樣本中顯著增高并且在所有口臭兒童舌苔樣本中都檢測到（圖 2B）。9個OTU的豐度在健康兒童和口臭兒童的唾液樣本中有顯著差異（圖 2C）：其中4個OTUs (L. wadei (OTU398)，Prevotella shahii (OTU283)，TM7 genus incertae sedis(OTU199) ，Solobacterium moorei (OTU30)) 在口臭兒童唾液樣本中顯著增高，但是只有P. shahii（otu283）多見于口臭兒童的唾液樣本（圖 2D）。

圖2.不同OTUs在健康和口臭樣品中之間的相對豐度和患病率差異

3. Beta多樣性分析：PCA分析發(fā)現(xiàn)一個趨勢：無論在唾液還是舌苔樣本中，健康兒童的樣本聚集的更緊密，而口臭兒童的樣本更分散。并且有兩個健康兒童樣本（藍(lán)色方塊4和5）落到口臭兒童樣本中，預(yù)示它有患口臭的風(fēng)險。

圖3.健康和口臭樣品的PCA分析

通過皮爾森相關(guān)系數(shù)獲得很多有相關(guān)性的OTUs，然后繪制健康兒童和口臭兒童唾液、舌苔微生物的共線網(wǎng)絡(luò)圖，25個唾液節(jié)點和2個舌苔節(jié)點在健康組間被篩選到（圖 4A）。23個舌苔節(jié)點和4個唾液節(jié)點在口臭組間被篩選到（圖4B）。同樣的而結(jié)果存在于組內(nèi)（圖4C,D），這些結(jié)果在健康和口臭的條件下唾液和舌苔中的微生物菌群存在不同的互作模式：健康人中起主要作用的是唾液中的OTUs，口氣兒童中起主要作用的是舌苔中的OTUs。

圖4.在健康和口臭的條件下唾液和舌苔中的微生物菌群存在不同的互作模式。綠色代表舌苔樣品中OTUs，紅色的點代表唾液樣品中OTUs。這些相關(guān)性分為組間相關(guān)性（即舌苔和唾液之間OTUs的相關(guān)性）（A,B），組內(nèi)相關(guān)性（即舌苔樣本內(nèi)OTUs的相關(guān)性或唾液樣本內(nèi)OTUs的相關(guān)性）（C,D）。

4. 組間功能和通路差異分析：4個混池樣本宏基因組測序共得到30.3 Gb數(shù)據(jù)，通過去除宿主基因組，基因拼接和基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)很多基因被口臭和健康兒童所共享。通過差異倍數(shù)>5和DEGexp（P<0.001）兩種方法取交集篩選到口臭兒童和健康兒童中的差異基因（圖5A，B），接著對這些差異基因進行KEGG/eggNOG注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“傳染?。杭?xì)菌”和“酮類化合物與萜類化合物代謝”這兩種通路的基因在口臭兒童中顯著富集。

圖5  口臭和健康兒童樣品中功能和通路差異分析

5. 某通路組間差異分析：細(xì)菌產(chǎn)生H₂S有兩條途徑：硫酸鹽降解以及半胱氨酸和蛋氨酸的desulphydration，通過比較口臭兒童和健康兒童中的差異基因，發(fā)現(xiàn)調(diào)控硫酸鹽降解的cysC在口臭兒童樣本中豐度更高（圖 6）。另外促進半胱氨酸和蛋氨酸desulphydration過程的cbs、aspB、yhdR、sseA 、glpE在口臭兒童樣本中基因豐度更高（圖 6），而編碼半胱氨酸合酶B，降解H2S 轉(zhuǎn)化成半胱胺酸的cysM在在口臭兒童樣本中基因豐度較低，以上兩種結(jié)果造成在口臭兒童樣本中相對于健康人中產(chǎn)生更高水平的H₂S。

圖6 口臭和健康兒童樣品中H2S代謝通路差異分析。差異倍數(shù)>2定為差異基因，用箭頭表示。向上的箭頭表示基因在口臭樣品中更豐富，向下的箭頭表示基因在口臭樣本比較少。差異倍數(shù)< 2的基因用“?”表示。舌苔樣本中的變化用在“[ ]”外面表示，唾液樣本中的變化用在“[ ]”內(nèi)部表示。