天昊生物客戶在《Applications in Plant Sciences》上發(fā)表中國特有針葉樹華山松的微衛(wèi)星標(biāo)記特征解析

發(fā)稿時間：2016-11-17來源：天昊生物

       西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中國西部資源生物與生物技術(shù)重點實驗室李忠虎教授課題組近期在《Applications in Plant Sciences》上發(fā)表了中國特有針葉樹華山松的微衛(wèi)星標(biāo)記特征解析的研究成果。在這項研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的基因組測序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Characterization of Polymorphic Microsatellite Markers in Pinus armandii

(Pinaceae), an Endemic Conifer Species to China

中文題目：中國特有針葉樹華山松的微衛(wèi)星標(biāo)記特征解析

研究背景:

華山松是一種常綠針葉樹種，是中國中部和西南部特有的樹種，以往對華山松的研究主要集中在其生理生態(tài)學(xué)，近年來，由于亂砍濫伐和自然棲息地破壞，華山松自然種群已顯著降低，因此了解其種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性對制定有效的保護和管理措施是十分必要的。在這項研究中，我們對華山松及其近源物種的SSR多態(tài)性進行了闡述從而有助于它們下一步的群體遺傳學(xué)研究。

研究結(jié)果：

1.    從新鮮針葉中提取基因組DNA，使用Illumina MiSeq PE300，得到6,783,777個clean reads，使用CLC Genomics Workbench version 7.5組裝得到350,628個contigs，使用SciRoKo version 3.1提取了含有SSR的contigs，從這些contigs中找到887個SSR候選位點，然后針對這些候選SSR位點設(shè)計引物，設(shè)計引物的標(biāo)準(zhǔn)是：（1）大小在100-350bp；（2）引物大小18-25 bp，最佳大小為20 bp；（3）引物熔解溫度從55°C-63°C，最佳熔解溫度為60°C；（4）GC含量為40%-60%。

2.    隨機挑選50對SSR引物在3個華山松自然群體的52個個體中測試其擴增效率和多態(tài)性。使用GenAlEx version 6.501來評價微衛(wèi)星位點的各種群體遺傳參數(shù)，包括每個位點的等位基因數(shù)，預(yù)期和觀測到的雜合度（He和Ho）和Hardy-Weinberg(HWE)，使用GENE-POP version 4.2.2來計算LD值， 并且使用MICRO-CHECKER version 2.2.3計算了無效等位基因頻率。

3.    50對SSR引物中共有34對引物成功擴增出PCR產(chǎn)物，其中18個位點表現(xiàn)出多態(tài)性（表1）。這些多態(tài)性引物的等位基因數(shù)范圍是2-5，平均2.4。

表1：34個SSR引物在華山松中的分型結(jié)果

4.    預(yù)期雜合度（He）范圍是0.061～0.609，平均0.384；觀測到的雜合度（Ho）范圍是0.063-0.947，平均0.436（表2）。兩對引物（pa3553和pa118137）HWE被發(fā)現(xiàn)大大偏離。這種偏差可能是樣本量不足，個體之間的非隨機交配，遷移，或自然選擇這兩個位點造成的。

表2：3個華山松自然群體的遺傳多樣性

5.   為了使開發(fā)的這些SSR位點得到更廣泛的應(yīng)用，本文檢測了這18對引物在其它5種與華山松較同源的松樹中（紅松、喬松、西伯利亞紅松、偃松、白皮松）的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這18對引物中有17對引物能在這5種松樹中擴增出明顯條帶，而引物pa3553在偃松和白皮松中則不能擴增出條帶（表3）。

表3：在華山松中呈現(xiàn)多態(tài)性的18個SSR引物在其它5種松樹中的分型結(jié)果

亮點：

本文利用華山松基因組測序數(shù)據(jù)采用de novo的方法拼接了一部分基因組contig，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了887候選SSR多態(tài)位點，再對其中一些候選SSR位點擴大樣本驗證其多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)18個SSR位點在華山松中確實具有多態(tài)性，然后在其它5種松樹發(fā)現(xiàn)17種SSR位點也具有多態(tài)性，從而找到了適合松樹遺傳多樣性研究的SSR位點。實際上華山松基因組測序數(shù)據(jù)除了挖掘基因組上的SSR位點，還可以將測序數(shù)據(jù)和參考基因組（近源物種）序列進行比對，去除核基因組序列 ，對其葉綠體基因組進行組裝拼接，從而得到其細胞器基因組序列。