WGS分析美國耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的傳播和進(jìn)化

發(fā)稿時(shí)間：2016-09-06來源：天昊生物

英文題目：Transmission and microevolution of USA300 MRSA in US households: evidence from whole-genome sequencing

中文題目：全基因組測序證實(shí)美國家族中USA300耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株的傳播和進(jìn)化

期刊名： mbio     發(fā)表時(shí)間： 2015,3      IF：6.975

單位: 美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)部感染性疾病與全球衛(wèi)生部門 

技術(shù)： Whole-genome sequencing

測序平臺： Illumina Hiseq 2000

材料： 146個(gè)芝加哥和洛杉磯USA300MRSA分離株、35個(gè)圣地亞哥USA300MRSA分離株、277個(gè)紐約USA300MRSA分離株

分析方法： denovo組裝/貝葉斯進(jìn)化樹/ ML系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

研究背景: 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300是美國重癥監(jiān)護(hù)患者發(fā)生遲發(fā)性院內(nèi)獲得性肺炎的一個(gè)重要原因，其作為一個(gè)有毒的，易于傳播的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，是美國家族中和MRSA菌株相關(guān)的最主要類群，這些細(xì)菌極易引起皮膚感染，壞死性肺炎和心內(nèi)膜炎等。研究者使用全基因組測序技術(shù)對來自于2008-2010年芝加哥和洛杉磯146個(gè)皮膚軟組織感染病人中分離得到的USA300MRSA菌株進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并與先前發(fā)表的USA300MRSA參考基因組（35個(gè)圣地亞哥+277個(gè)紐約）進(jìn)行比較，結(jié)果顯示了菌株SNPs位點(diǎn)及全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析，從而了解了菌株的傳播動(dòng)力學(xué)，遺傳相關(guān)性和USA300MRSA在家族內(nèi)的微進(jìn)化等，從而為限制社區(qū)中MRSA的傳播提供了可行性策略。

研究結(jié)果：

家族中USA300 MRSA菌株持續(xù)性

146個(gè)洛杉磯和芝加哥USA300分離菌株中，每個(gè)菌株測序深度約~200×，隸屬于ST8序列類型。通過對所有菌株中均存在的2,203,292-bp的核心核苷酸序列進(jìn)行貝葉斯分析預(yù)估出這些菌株共有祖先的年代。圖1中，藍(lán)色分支菌株來自于芝加哥，黑色分支菌株來自于洛杉磯，紅色和綠色分支分別是USA300 的TCH1516和FPR3757參考菌株。對氟喹諾酮敏感(攜帶grlA84S和gyrA80S)和耐氟喹諾酮（攜帶grlA84Y和gyrA80L）的分支分別由縱軸的綠色和紅色區(qū)分。箭頭處表示具有g(shù)rlA84F和gyrA80L基因型的單個(gè)菌株。研究者還發(fā)現(xiàn)USA300菌株最近的共有祖先的預(yù)估年代為1993年，而這也與MRSA菌株在美國社區(qū)疾病傳播發(fā)生的年代相一致。此外，還發(fā)現(xiàn)抗氟喹諾酮藥性出現(xiàn)在1995年。

圖1  146株USA300菌株核心基因組的貝葉斯分析結(jié)果

USA300泛基因組的持續(xù)性改變

通過將146株USA300菌株序列草圖和NCBI上49株金黃色葡萄球菌的基因組完成圖中的泛基因組組成（ 3,455個(gè)核心基因和非核心基因）進(jìn)行比較，基于基因家族存在和缺失的模式發(fā)現(xiàn)所有的USA300菌株都聚在相同的分支上（圖2）。

圖2  146株USA300菌株和46株金黃色葡萄球菌的基因存在和缺失熱圖。紅色和藍(lán)色分別代表基因簇的存在和不存在。

圖3為芝加哥家族9033的USA300分離菌株的ACME基因組缺失圖，最外面兩層表示USA300菌株TCH1516的參考基因組（深藍(lán)色）；藍(lán)色區(qū)域表示芝加哥家族9033菌株基因組概況，每個(gè)圓圈表示一個(gè)菌株，藍(lán)色區(qū)域最外層標(biāo)志性感染菌株120381含有ACME，而芝加哥家族9033的其余12個(gè)USA300分離菌株則丟失ACME精氨酸代謝移動(dòng)元件；USA300參考菌株FPR3757（桔色）則存在ACME，這些結(jié)果說明在菌株上原來存在的基因島發(fā)生了丟失（圖3），可見家族中USA300菌株的基因組構(gòu)型在進(jìn)化過程中發(fā)生改變。

圖3  BLASTmap顯示芝加哥家族9033的USA300分離菌株發(fā)生了ACME基因缺失

家族中USA300菌株的聚類

對家族中USA300所有菌株，基于1629個(gè)（約130Mbp）核心蛋白質(zhì)類群建樹（圖4），圖4中每個(gè)圓圈代表了一個(gè)單獨(dú)的基因型，每種顏色表示不同的家族類型。圓圈大小和具有此基因型菌株的數(shù)量成正比。家族中標(biāo)號由CH（芝加哥）和LA（洛杉磯）分別表示。圖中星號所標(biāo)志菌株表示受感染的菌株。根據(jù)有無gylA80Y和gyrA84L基因突變（耐氟喹諾酮）將所有的USA300菌株分為CladeI和CladeII，可見菌株間明顯區(qū)分為兩個(gè)大支（clade I和clade II）。21個(gè)家族中有18個(gè)家族各自聚為單源類群，揭示出每個(gè)家族中均由一個(gè)單獨(dú)的USA300菌株進(jìn)化而來。

圖4 所有USA300菌株家族遺傳相關(guān)性最小化生成樹圖（MST）

USA300菌株氟喹諾酮耐藥性的進(jìn)化

為了鑒別驅(qū)使菌株聚類的遺傳變異性因素，研究者使用全基因組 Weir and Cockerham’s FST分析（圖5），發(fā)現(xiàn)芝加哥和洛杉磯分離菌株中有8個(gè)SNPs位點(diǎn)具有顯著性差異，三個(gè)非同義包括與耐氟喹諾酮相關(guān)的gylA80Y和gyrA84L突變以及與細(xì)胞壁中主要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)的whiA D17E。

圖5  146個(gè)USA300MRSA菌株1595個(gè)SNP位點(diǎn)Weir and Cockerham’s FST分析

USA300菌株氟喹諾酮耐藥性不受地理位置的約束

基于來自于圣地亞哥，洛杉磯，芝加哥和紐約的核心基因組序列（約2.1Mbp）使用REALPHY軟件建樹。圖6中對氟喹諾酮敏感的菌株由綠色分支表示，耐氟喹諾酮菌株由紅色分支表示，5個(gè)耐氟喹諾酮菌株有不同的突變(grlA 80F and gyrA 84L)，用桔紅色表示，3個(gè)菌株只有在grlA基因上有突變(80F)，用紫色表示。兩個(gè)非USA300菌株（Newman和COL）以及兩個(gè)USA300參考菌株（TCH1516和FPR3757）圖中右側(cè)由空心圓圈表示。來自于不同地區(qū)的菌株在圖中右側(cè)分別由不同顏色表示。結(jié)果顯示根據(jù)有無gylA80Y和gyrA84L突變(耐氟喹諾酮)菌株們可分為兩大分支。還發(fā)現(xiàn)耐氟喹諾酮的USA300菌株在圣地亞哥（28/35，占80%），洛杉磯（59/70，84.2%）和紐約（186/277，67.1%）廣泛分布，比芝加哥地區(qū)（23/75，30.6%）相比均有顯著性差異（P<0.0001），說明USA300菌株氟喹諾酮耐藥性的發(fā)育進(jìn)化不受地理位置的約束。

圖 6  460個(gè)US300菌株（458+2株非USA300菌株）的ML樹圖

研究結(jié)果：

●  與先前發(fā)表的USA300MRSA參考基因組（35個(gè)圣地亞哥+277個(gè)紐約）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)來自于圣地亞哥(SNP數(shù)目:17.6; 核苷酸多樣性: Л值3.1 *10 ^-5 )和芝加哥(SNP數(shù)目:12; 核苷酸多樣性: Л值3.1 *10 ^-5 )的菌株遺傳變異性很低。

●  一個(gè)家族內(nèi)的菌株各自聚為關(guān)系較近的單源類群，并且一個(gè)家族內(nèi)的菌株是由一個(gè)共同的祖先USA300菌株發(fā)育而來。
●  根據(jù)貝葉斯進(jìn)化樹家族推測USA300菌株最近的共有祖先的預(yù)估年代為1993年，而USA300菌株的抗氟喹諾酮藥性出現(xiàn)在1995年。
●  USA300菌株氟喹諾酮耐藥性不受地理位置的約束，并且耐氟喹諾酮的USA300菌株在于洛杉磯和紐約傳播更廣。