結(jié)核分支桿菌臨床分離菌株的比較基因組學分析

發(fā)稿時間：2016-09-02來源：天昊生物

英文題目：Comparative genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates

中文題目：結(jié)核分支桿菌臨床分離菌株的比較基因組學分析

期刊名： BMC Genomics    發(fā)表時間：2014,6       IF：3.867

技術(shù)： Whole genome sequencing（PE100）

測序平臺：Illumina 測序平臺

材料： 7株結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株

研究背景:

由于過多抗生素的使用，抗藥性的結(jié)核分枝桿菌已成為許多國家嚴重威脅公共衛(wèi)生和疾病控制的主要障礙。為了更好了解抗藥性結(jié)核分枝桿菌菌株的進化，研究者對7株具有不同抗藥性范圍的結(jié)核分支桿菌分離株進行全基因組測序，且通過比較基因組學分析基因變異性。

分析方法：SOAP denovo組裝/COG/KEGG功能注釋/MEGA5進化樹構(gòu)建

研究結(jié)果：

全基因組序列統(tǒng)計

表1是7株臨床分離菌株信息，包括抗藥類型，年齡，抗藥圖譜，分離時間等相關(guān)信息。每個菌株基因組序列覆蓋度在200-560×，完整度在97.43-97.82%。通過與參考臨床分離菌株H37Rv基因組序列進行對比，發(fā)現(xiàn)7株菌株的抗藥圖譜不同，且有著相似的SNPs（數(shù)量范圍從1409-1464）和Indels(56-101)。

表1：臨床結(jié)核分枝桿菌的流行病學和臨床資料。INH, 異煙肼; RMP, 利福平; STR, 鏈霉素; EMB,乙胺丁醇; PZA,吡嗪酰胺; OFX,氧氟沙星; LVX, 左氧氟沙星; KAN, 卡那徽素; CAP,卷曲霉素;AMK, 氨基羥丁基卡那霉素A; PAS, 對氨基水楊酸; ETH, 硫異煙胺.

結(jié)核分支桿菌基因組中SNP聚類和分布

通過進一步的基因組學比較分析，總共有1871個非重復性SNPs，其中7株菌株共有的有1102個SNPs。SNP密度圖顯示了SNPs的非隨機分布，有25個區(qū)域有較高的SNP密度（圖1中的紅色條帶）。通過進一步不同等級的COG注釋進一步分析了SNP的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較少SNPs富集在于次級代謝生物合成，運輸和代謝相關(guān)基因上（Class Q），較多SNP富集在一些未知功能基因上（Class S），細胞壁/膜合成（Class M），通用功能（Class M），防御機制（Class V），翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和合成（Class J），轉(zhuǎn)錄（Class K），信號轉(zhuǎn)導（Class T），細胞移動（Class N）。

圖1 SNP密度Circos分布圖。綠色帶表示非重疊5K區(qū)段內(nèi)的SNP密度；紅色帶表示具有顯著SNP高密度的區(qū)域。

染色體組的插入和缺失

和H37Rv菌株進行對比發(fā)現(xiàn)本研究中的菌株有大片段插入和缺失（插入或者缺失片段至少20bp長度），共發(fā)現(xiàn)了并發(fā)現(xiàn)了1個菌種非特異性和29個菌種特異性大片段插入，2個菌種非特異性和61個菌種特異性大片段缺失。并在抗原變異主要來源PE-PPE-PGRS基因上發(fā)現(xiàn)了16處Indel。許多Indels在對藥物敏感和抗藥性菌株中被確定。

結(jié)核分支桿菌基因組中CRISPR的分布

使用CRISPRfinder去推測7株結(jié)核分支桿菌菌株基因組中的CRISPR位點。與已預測出有兩個CRISPR結(jié)構(gòu)的實驗室分離株H37Rv進行比較，發(fā)現(xiàn)本研究中的7株臨床分離菌株和先前測序的其他兩株臨床結(jié)核分枝桿菌菌株(CCDC5079，CCDC5180)只有這兩個CRISPR結(jié)構(gòu)中的一個。且證實抗生素的耐藥性和CRISPR-case區(qū)之間沒有相關(guān)性。

結(jié)核分支桿菌中與抗藥性相關(guān)的基因突變

通過分析比較發(fā)現(xiàn)7株中國臨床分離菌株中共有39種類型的突變與抗藥性相關(guān)，包括14個先前已經(jīng)報道的，以及25個新鑒定出的位點?？顾幈硇秃屯蛔冎g的關(guān)聯(lián)在不同藥物之間變化很大（例如isoniazid的抗藥性相關(guān)位點在不同菌種之間完全相同，而para-aminosalicylic acid的抗藥性相關(guān)位點在不同菌種之間完全不同）。7株中國臨床分離菌株中與抗藥性相關(guān)的突變請見表2。

表2：7株中國臨床分離菌株中與抗藥性相關(guān)的SNP位點和插入

結(jié)核分支桿菌基因組的遺傳多樣性和選擇強度

使用結(jié)核分支桿菌全基因組序列進行遺傳多樣性和選擇強度分析，結(jié)果顯示這7個新的臨床分離菌株有著相似的核苷酸多樣性（Л值），分布范圍在0.00033到0.00036，在對藥敏感和抗藥菌株之間核苷酸多樣性無顯著性差異(0.00024 vs. 0.00021)，而在臨床分離菌株和實驗室分離菌株之間則有顯著性差異（0.00033 vs. 0.00004）。這7個新的臨床分離菌株和5個以前描述過的臨床分離菌株之間的Л值有明顯區(qū)別(0.00008 vs. 0.00057)。

全基因組序列的dN/dS值在具有不同抗藥圖譜的分離菌株之間很相似，數(shù)值分布在0.608885-0.637365之間，在對藥敏感和抗藥菌株間無顯著性差異，而臨床分離菌株的dN/dS值顯著低于實驗室分離菌株(0.66018 vs. 0.765664)。

表3：結(jié)核分支桿菌全基因組序列的遺傳多樣性（Л值）和選擇強度分析（dN/dS）

結(jié)核分支桿菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用鄰接法(NJ)和最大相似性（ML）兩種方法對7株菌株和其他7株結(jié)核分支桿菌全基因組中的SNPs進行菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示不同的臨床分離菌株的進化關(guān)系在兩種進化樹中是相似的。這7株新的結(jié)核分支桿菌臨床分離株與和之前北京地區(qū)菌株CCDC5079和CCDC5180在進化樹中形成一個分支，表明進化親緣關(guān)系較近。

圖2 基于全基因組中的SNPs菌株間的進化關(guān)系

研究結(jié)果：

     ? 結(jié)果發(fā)現(xiàn)7株不同抗藥圖譜的臨床分離菌株有著相似數(shù)目的SNPs，數(shù)量范圍從1409-1464。大片段的插入和缺失（Indels）數(shù)量也很相似(56-101)。

     ? 通過對抗性數(shù)據(jù)庫注釋發(fā)現(xiàn)39處與抗藥性相關(guān)的變異，包括14處先前報道的位點以及25處新的位點，并在抗原變異主要來源PE-PPE-PGRS基因上發(fā)現(xiàn)了16處Indel。

     ? 發(fā)現(xiàn)了一個在7株臨床分離菌株上具有不同間隔的CRISPR簇，表示它在結(jié)核分支桿菌基因組可塑性上發(fā)揮著重要作用。

     ? 7株臨床分離菌株基因組的核苷酸多樣性（(Л值）和選擇強度（dN/dS值）非常相似，所有7株臨床分離菌株的dN/dS值都小于1（范圍從0.608885到0.637365），這表明結(jié)核分枝桿菌基因組正在經(jīng)歷凈化選擇作用。藥物敏感菌株和抗藥性菌株的核苷酸多樣性（(Л值）和選擇強度（dN/dS值）是相似的。

總體評價：

      本研究采用全基因組測序，揭示了臨床結(jié)核分支桿菌分離菌株在遺傳組成上有一定的相似性，而在SNP的分布，Indels，CRISPR-cas結(jié)構(gòu)及核苷酸多樣性，選擇強度上有明顯的變化。通過COG功能注釋顯示藥物敏感菌株和抗藥性菌株在基因組水平上并沒有顯著的差異，表明臨床分離菌株的抗藥性進化過程是十分復雜而多變的。除此之外，研究還需要對幾個問題進行深入的調(diào)查，如菌株的藥物敏感度是否受特定基因的缺失和特定代謝途徑的影響，選用更多的來自于不同分支類群的結(jié)核分支桿菌菌株更好地了解耐藥性結(jié)核分支桿菌的進化演變等等。