擴增子測序分析普洱茶生茶和熟茶的微生物組成

發(fā)稿時間：2016-08-16來源：天昊生物

英文題目：The Microbiome and Metabolites in Fermented Pu-erh Tea as Revealed by High Throughput Sequencing and Quantitative Multiplex Metabolite Analysis

中文題目：通過高通量測序和定量多重代謝產(chǎn)物分析發(fā)酵普洱茶微生物組及其代謝產(chǎn)物

期刊名：PLoS One      發(fā)表時間：2016.6        IF：3.057

技術(shù)：真菌ITS1區(qū)擴增子測序和細菌16S V4區(qū)擴增子測序

測序平臺：Illumina Miseq測序平臺

材料： 7片野茶樹新鮮葉片&31個普洱茶葉片樣本（15個生茶&16個熟茶）

分析方法：

        ?  ITS1擴增子測序使用UNITE數(shù)據(jù)庫;

        ?  16SV4擴增子測序使用Greengenes數(shù)據(jù)庫;

        ?  QIIME計算alpha多樣性(observed richness, Chao 1, Shannon, Simpson Evenness);

        ?  PCoA&NMDS分析beta多樣性;

        ?  R中vegan軟件包進行群落相似差異性分析（Adonis&ANOSIM）;

        ?  Venn圖比較組間共有和特異OTU類群;

        ?  使用R中indicspecies軟件包篩選組間代表性物種;

        ?  Mantel檢驗真菌和細菌群落組成的潛在相互關(guān)系;

研究背景:

  茶在中國是最受歡迎和流行的消費飲品之一。常常產(chǎn)自于兩種不同類型的茶樹上，野茶樹和普洱茶樹。根據(jù)不同的處理過程，茶至少分為6中類型：綠茶，黃茶，白茶，紅茶和黑茶。它們當中黑茶是最特別地，由于黑茶發(fā)酵過程中微生物的變化，將持續(xù)數(shù)月或者許多年。普洱茶就是黑茶的一種，分為生茶和熟茶的兩種葉片類型。一種是傳統(tǒng)的生茶原始發(fā)酵方式得來稱為生茶，一種是速度較快的熱熟茶的發(fā)酵方式成為熟茶。雖然一些研究已經(jīng)調(diào)查了不同發(fā)酵時間普洱茶的微生物多樣性，但沒有人研究過新鮮葉片，生茶以及熟茶葉片去微生物群落特征，及細菌群落和真菌群落組成以及與環(huán)境因子之間的關(guān)聯(lián)性。研究者采集了中國云南的7片野茶樹新鮮葉片和31個普洱茶葉片樣本（15生茶和16熟茶），旨在解決以下問題：1.鑒別普洱茶中微生物多樣性和組成；2.比較新鮮葉片，自然加工普洱茶以及熟茶普洱茶中的微生物群落結(jié)構(gòu); 3.找出影響普洱茶微生物群落的潛在因素; 4.鑒定出普洱茶中的微生物代謝產(chǎn)物。

研究結(jié)果：

微生物物種豐度和群落組成

通過真菌ITS1區(qū)和細菌16SV4區(qū)擴增子高通量測序，每個樣本含有超過了42383條真菌ITS序列和29721條細菌序列。進一步去除singleton，Chimera序列以及一些低豐度的OTU序列，得到每個樣本約39507-214960條真菌序列和66-305472條細菌序列。通過與其它樣本比較，發(fā)現(xiàn)新鮮葉片和一些生茶茶葉樣本中細菌序列數(shù)目過少是由于序列中葉綠體序列過多導致（圖1），新鮮葉片中占86.23%（紅色線條），生茶葉片中約占65.81%（藍色線條），而熟茶葉片中僅有0.09%（橙色線條），這些序列在分析中會被去除。最后去除物種豐度低于0.005%的序列共得到了390個真菌OTU（每個樣本65-175個OTU）和629個細菌OTU（每個樣本18-466個OTU）。

圖1：葉綠體序列在每個樣本細菌序列中的比例。

圖2顯示大多數(shù)真菌物種隸屬于子囊菌門（305個OTU，91.67%），細菌物種隸屬于放線菌門（172個OTU，43.16%），厚壁菌門（220個OTU，37.01%）和變形菌門（158個OTU，13.89%）。

圖2：分配到每個真菌/細菌門的相對比例。對真菌來說，無論是OTUs (a)還是序列(b)子囊菌門是最豐富的。對細菌來說，無論是OTUs (c)還是序列(d) 放線菌門，變形菌門和厚壁菌門是豐度最高的。

新鮮葉片，生茶和熟茶的普洱茶葉片中微生物群落比較

將三種不同類別的葉片序列通過Venn圖分析發(fā)現(xiàn)（圖3.a&圖3.b），真菌物種中僅1/4（107/390）序列，細菌物種中僅1/6（107/629）序列為三種不同類別葉片所共有，暗示三種不同類型葉片中微生物群落組成的差異顯著性。從共有OTU數(shù)目統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)新鮮葉片和普洱茶葉片（生茶和熟茶）共享54%（173/318）的真菌物種和22%（138/625）的細菌物種，表明新鮮葉片是普洱茶發(fā)酵過程中重要的微生物儲備場所。此外，為篩選出每個樣本類型中特異OTU對微生物群落的影響，對三種葉片類型的前100個豐度最高的OTU進行Venn圖分析（圖3.c&圖3.d），發(fā)現(xiàn)三種不同類型葉片中共有的真菌和細菌比例急劇上升。

圖3：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）的普洱茶 Venn圖分析

將不同樣本序列抽頻到相同的序列深度進行alpha多樣性預估（圖4），發(fā)現(xiàn)新鮮葉片（紅色）比生茶（藍色）和熟茶（橙色）的普洱茶葉片有著更多的真菌物種和更少的細菌物種。

圖4：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）細菌（a）和真菌（b）物種豐度的稀釋性曲線分析

真菌中（圖5.a-d），新鮮葉片和普洱茶葉片（生茶和熟茶）的alpha多樣性指數(shù)（observed species、Chao1、Shannon、Simpson-e）有著顯著性差異，而生茶和熟茶的普洱茶葉片之間均無顯著性差異。細菌中（圖5.e-h），熟茶的普洱茶葉片中的豐富度比新鮮葉片和生茶的葉片顯著性升高，而香農(nóng)和辛普森指數(shù)未顯著性升高。

圖5：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）細菌和真菌的alpha多樣性分析

使用PCoA（圖6）和NMDS（圖7）分析了真菌和細菌群落Beta多樣性，結(jié)果均顯示出一致性結(jié)果，即在新鮮葉片和普洱茶葉片（生茶和熟茶）之間細菌群落組成有顯著性差異。有趣的是發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間最老的普洱茶葉片（A6）與熟茶的普洱茶葉片更具有群落相似性，尤其是在真菌群落結(jié)構(gòu)中。且通過ANOSIM和ADONIS分析對群落相似性進行檢驗（表1），結(jié)果顯示三種不同葉片類型的微生物群落結(jié)構(gòu)均有顯著性差異。

 

圖6：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）真菌 (a)和細菌 (b)的PCoA分析。藍色箭頭所指的是發(fā)酵時間最老的普洱茶葉片（A6，28年）。

圖7：新鮮葉片（紅色），生茶（藍色）和熟茶（橙色）真菌 (a)和細菌 (b)的NMDS分析。

表1：新鮮葉片，生茶和熟茶之間真菌和細菌的ANOSIM和ADONIS分析。

      此外，通過R中indicspecies軟件包在不同類型葉片中篩選出許多指示性物種（表2），發(fā)現(xiàn)熟茶的普洱茶葉片的指示物種為一些嗜熱或者耐熱真菌和細菌，兩個指示性物種（曲霉菌和Blastobotrys adeninivorans）在普洱茶葉片（生茶和熟茶）中被發(fā)現(xiàn)，它們可以作為普洱茶葉片中主要的兩大指示性物種，而這個結(jié)果也被先前的可培養(yǎng)研究和不可培養(yǎng)研究結(jié)果所證實。

表2：在新鮮葉片，生茶和熟茶中檢測到的真菌/細菌指示物。

外界因素對普洱茶葉片群落結(jié)構(gòu)變異的影響

      研究者調(diào)查了4個外界因素對普洱茶葉片群落變異的影響，包括時間，產(chǎn)地，純茶VS污染的茶葉，未壓縮茶葉VS壓縮茶葉等。為了研究葉片發(fā)酵時間對微生物群落變異的影響，研究者將生茶和熟茶的普洱茶葉片樣本分成兩組（幼葉片和老葉片），或者三組（幼嫩，半老和老葉片）。在上述幾種外界因素中，只有葉片發(fā)酵時間顯著影響著群落結(jié)構(gòu)，通過ANOSIM和ADONIS分析比較發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間僅僅對生茶造成顯著性影響。熟茶和相對應時間生茶有著相似的微生物群落，且與那些發(fā)酵時間短的生茶葉片有著明顯區(qū)別。

表3：ANOSIM和ADONIS分析檢測四個外界因素對生茶和熟茶真菌和細菌的群落結(jié)構(gòu)變異的影響。

Mantel檢驗真菌和細菌群落間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)在生茶中真菌和細菌兩種微生物群落間無相關(guān)性。而16個熟茶的真菌和細菌群落之間有顯著性相關(guān)性（P=0.004），當去除有其它植物污染的7個熟茶茶葉樣本時發(fā)現(xiàn)熟茶的茶葉真菌和細菌群落之間也無顯著相關(guān)性。

表4. Mantel檢驗生茶和熟茶的真菌和細菌群落間的相關(guān)性

普洱茶葉片中產(chǎn)毒真菌及其毒素

      存在于所有樣本中的15個最高豐度真菌中有幾個真菌是產(chǎn)毒真菌，例如尼日爾曲霉、局限曲霉、桔青霉。接著對所有的普洱茶葉片樣本通過LC-MS/MS進行真菌毒素檢測，共發(fā)現(xiàn)了25個化學物質(zhì)，大多數(shù)化合物濃度都很低。其中5個在所有的葉片中被發(fā)現(xiàn)，包括: asperglaucide, brevinamide F, emodine, neoechinulin A, andusnic acid等，并且asperglaucide無論是在生茶還是熟茶的葉片中濃度都是最高的。

 

圖8：生茶（藍色）和熟茶中真菌毒素檢測。

結(jié)果總結(jié)：

這是一篇比較典型利用miseq測序平臺結(jié)合真菌ITS區(qū)與細菌16S區(qū)域?qū)ξ⑸锒鄻有砸约叭郝浣M成等展開研究，探究真菌群落與細菌群落之間的相關(guān)性。適合推薦給真菌與細菌群落多樣性結(jié)合研究的客戶。

1. 群落組成分析：在新鮮葉片和生茶或者熟茶發(fā)酵的普洱茶葉片之間細菌群落組成顯示出顯著性差異。   

2. alpha多樣性分析：生茶或者熟茶發(fā)酵的普洱茶葉片真菌群落多樣性降低，細菌群落多樣性升高。

3. Beta多樣性分析：熟茶和相對應時間生茶的普洱茶葉片有著相似的微生物群落，且與那些發(fā)酵時間短的生茶葉片有著明顯區(qū)別。

4. 外界因素：時間顯著影響著生茶發(fā)酵的普洱茶葉片，而熟茶則顯示出相反的趨勢。

5. 其他分析（如毒素代謝產(chǎn)物檢測）：對茶葉片樣本通過LC-MS/MS進行真菌毒素檢測，共發(fā)現(xiàn)了25個毒素代謝產(chǎn)物，其中asperglaucide酰胺類和棒曲霉素占據(jù)主導地位 。