囊性纖維化呼吸道微生物組解析

發(fā)稿時(shí)間：2016-07-22來(lái)源：天昊生物

英文題目：Insights into the respiratory tract microbiota of patients with cystic fibrosis during early Pseudomonas aeruginosa colonization

中文題目：對(duì)銅綠假單胞菌定植早期的囊性纖維化患者的呼吸道微生物組進(jìn)行解析

期刊名：SpringerPlus       發(fā)表時(shí)間： 2015           

研究背景: 慢性肺部感染是囊性纖維化（CF）發(fā)病率和死亡率的主要原因。CF患者的呼吸道在早期被許多細(xì)菌定植和感染，這些細(xì)菌包括銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、洋蔥伯克氏菌、氧化木糖無(wú)色桿菌，而銅綠假單胞菌是囊性纖維化（CF）最主要的病原體。有研究表明在CF孩子患者中，銅綠假單胞菌的定植與肺功能逐漸惡化有縱向相關(guān)性，因此在早期檢測(cè)銅綠假單胞菌可以最大限度地有效控制這種病原體，而更好了解銅綠假單胞菌感染的初始步驟，將有助于防止它在CF病人呼吸道的早期定植。基于此，本文對(duì)CF患者銅綠假單胞菌定植初期的呼吸道微生物群落結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)變化通過(guò)焦磷酸測(cè)序進(jìn)行了解析。

材料：5個(gè)囊性纖維化患者（CF），其年齡范圍是5–19歲，隨訪周期是16–39 個(gè)月（平均22個(gè)月），共計(jì)收集到20個(gè)痰樣本（每個(gè)病人平均4個(gè)樣本）。痰標(biāo)本質(zhì)量通過(guò)新鮮涂片細(xì)胞學(xué)檢查進(jìn)行了驗(yàn)證。所有的樣品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)銅綠假單胞菌感染狀態(tài)進(jìn)行了鑒定，并分為兩組：3個(gè)病人被定義為‘free’ (至少在前一年沒(méi)有銅綠假單胞菌定植)；2個(gè)病人被定義為‘never’(在痰或咳嗽拭子中從沒(méi)有檢測(cè)到銅綠假單胞菌定植)。所有患者在后續(xù)隨訪中均是銅綠假單胞菌陽(yáng)性。

技術(shù)：16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序（V3-V4）；

測(cè)序平臺(tái)：Roche 454 FLX 測(cè)序平臺(tái)

研究結(jié)果：

呼吸道微生物多樣性

結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣本細(xì)菌多樣性非常高，平均Shannon指數(shù)達(dá)到3.58，這與其它相關(guān)研究得到的結(jié)果相符；Good's coverage指數(shù)(0.999)表明發(fā)現(xiàn)了大部分的細(xì)菌種類；每個(gè)樣品的Chao-1菌群豐度指數(shù)僅比實(shí)際觀察到的OTUs數(shù)目稍高，這表明真實(shí)菌群豐度沒(méi)有被低估。推測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)高細(xì)菌多樣性是因?yàn)檫@些病人的年齡均非常年輕（平均10歲），據(jù)報(bào)道這個(gè)年齡段的細(xì)菌多樣性是最高的。

CF患者核心肺部菌群

共計(jì)58個(gè)OTUs構(gòu)成了CF患者核心菌群。如圖1所示，鑒定到5個(gè)門: 厚壁菌門，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和梭桿菌門。這個(gè)核心CF肺菌群是由13個(gè)主要屬構(gòu)成 (相對(duì)豐度 >1 %) ，它們的總量達(dá)到核心reads的94 % 。實(shí)際上本研究發(fā)現(xiàn)的這13個(gè)CF核心肺部菌樹(shù)在所有CF患者呼吸道微生物相關(guān)研究中都被發(fā)現(xiàn)過(guò)，其中9個(gè)菌屬還是健康人肺部豐度最高的菌屬。與以前的研究相符，本研究也發(fā)現(xiàn)了豐度較高的厭氧菌（如韋永氏球菌屬和普氏菌）和兼性厭氧菌（如麻疹），而這兩類菌被認(rèn)為是CF病人肺部惡化的生物標(biāo)記物。      

研究還發(fā)現(xiàn)屬于相關(guān)口腔微生物的細(xì)菌（例如TM6, TM7 , WPS-2）也低豐度地存在于痰樣本中，雖然TM6和WPS-2已經(jīng)被報(bào)道存在于痰樣本中，但是TM7卻是第一次被發(fā)現(xiàn)存在于痰樣本中。而在CF兒童的痰樣本中發(fā)現(xiàn)這類口腔微生物從側(cè)面也證實(shí)了一個(gè)觀點(diǎn)：口腔是潛在病原體的來(lái)源，例如厭氧菌，它能到達(dá)并定植在CF患者的下呼吸道。

圖1: （CF）病人核心肺部菌群的細(xì)菌多樣性系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。內(nèi)環(huán)不同顏色代表來(lái)自5個(gè)不同的門；每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)核心OTUs（在50%的樣品都存在的菌群，并且相對(duì)豐度大于總細(xì)菌群落的0.1%）；外面的柱狀代表5個(gè)CF病人每個(gè)OTUs的相對(duì)豐度。

銅綠假單胞菌定植早期的CF患者呼吸道菌群動(dòng)態(tài)變化

如圖2A所描繪的 ，在銅綠假單胞菌定植早期CF患者呼吸道菌群在生物量上雖然有波動(dòng)，但是每個(gè)個(gè)體的菌群結(jié)構(gòu)還是相對(duì)穩(wěn)定的，可以明顯分為五組。

圖2A：5個(gè)CF患者菌群結(jié)構(gòu)的PCoA分析(患者A, 紅色倒三角; 患者B, 藍(lán)三角; 患者C, 橙色圈; 患者D, 綠色三角; 患者E, 紫色方塊)。

厭氧菌存在的持續(xù)性

隨著銅綠假單胞菌早期定植過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)9個(gè)OTUs以較高的豐度持續(xù)存在于所有樣本中，這其中包括六個(gè)屬，包括3個(gè)專性厭氧菌（韋榮球菌屬、放線菌屬和普雷沃菌屬），和3個(gè)兼性厭氧菌（流感嗜血桿菌屬，顆粒鏈菌屬和鏈球菌屬）（圖 3），這說(shuō)明厭氧菌在CF患者的病理生理學(xué)中發(fā)揮了重要作用，這是因?yàn)樗鼈儏⑴c炎癥，感染和肺功能。

本研究關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題是到底是銅綠假單胞菌的植入隨后引起了厭氧菌的增殖還是反過(guò)來(lái)厭氧菌的增殖引起了銅綠假單胞菌的定植。在最初的“never”組(在痰或咳嗽拭子中從沒(méi)有檢測(cè)到銅綠假單胞菌定植)所有樣本中都檢測(cè)到相同的厭氧菌屬，幾個(gè)月以后這些人都感染了銅綠假單胞菌，這表明厭氧菌并不阻礙銅綠假單胞菌的植入。事實(shí)上，許多測(cè)序結(jié)果顯示，常見(jiàn)的肺部疾病除了一些眾所周知的肺部病原微生物，還存在一類核心菌群，它包括4個(gè)持續(xù)存在的厭氧菌屬（韋榮球菌屬、鏈球菌屬、放線菌、普雷沃菌屬），這表明存在一種“近墨者黑”的現(xiàn)象，即最主要病原菌對(duì)于銅綠假單胞菌群的植入起決定性作用，然而這四個(gè)菌屬作為銅綠假單胞菌植入促進(jìn)劑的作用仍有待明確。

圖3:CF患者痰樣本13主要菌屬的聚類分析。每個(gè)臨床狀態(tài)被注明 (B：基線臨床狀態(tài); E：肺加重; T：治療發(fā)作期; R：恢復(fù)期; MD：數(shù)據(jù)缺失；每一個(gè)菌屬的相對(duì)豐度用紅色（高豐度）或者黃色、亮白色（低豐度）標(biāo)注。

微生物結(jié)構(gòu)與銅綠假單胞菌感染狀態(tài)相關(guān)

接著通過(guò)比較“never”組(在痰或咳嗽拭子中從沒(méi)有檢測(cè)到銅綠假單胞菌定植)和“free”組(至少在前一年沒(méi)有銅綠假單胞菌定植) CF病人菌群來(lái)判斷銅綠假單胞菌是否影響呼吸道菌群結(jié)構(gòu)。首先發(fā)現(xiàn)兩組病人間細(xì)菌密度和銅綠假單胞菌reads數(shù)目沒(méi)有差異，接著發(fā)現(xiàn)這兩組CF病人間的菌群多樣性指數(shù)（Shannon）和菌群均勻度也沒(méi)有差異，然而菌群豐度在兩組CF病人間存在差異：“never”組病人的菌群豐度[Chao-1: 79.8 (72.03–87.61); 實(shí)際觀察到的菌種數(shù)目: 71.6 (63.85–79.43)]要比“free”組病人[Chao-1: 62.7 (52–73.5); 實(shí)際觀察到菌種數(shù)目:55.9 (45.24–66.71)]的菌群豐度更高，因此CF病人呼吸道菌群豐度直接受銅綠假單胞菌首次植入的負(fù)調(diào)控。另外，如圖2B和圖S3所示，CF病人呼吸道菌群結(jié)構(gòu)受銅綠假單胞菌不同感染狀態(tài)的影響。

圖2B：“never”組(紅色圓圈)和“free”組(藍(lán)色方塊)CF病人菌群結(jié)構(gòu)PCoA分析。

圖S3：CF病人肺部微生物組屬水平上的分類柱狀圖。

結(jié)果總結(jié)：

l  CF病人的呼吸道微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很高的多樣性，并且這與CF病人的較小年齡相關(guān)。

l  鑒定到一個(gè)核心CF肺部菌群，它是由來(lái)自于5個(gè)門的13個(gè)主要菌屬構(gòu)成的，其中大多數(shù)是專性厭氧菌。

l  個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)有明顯的變化。

l  CF病人呼吸道菌群豐度直接受銅綠假單胞菌首次植入的負(fù)調(diào)控。

l  無(wú)論銅綠假單胞菌感染狀態(tài)如何一類厭氧菌群都持續(xù)存在，這表明它們?cè)贑F患者肺部的感染病理生理學(xué)中發(fā)揮著重要作用，因此某些菌屬可能是肺部感染時(shí)期的潛在生物標(biāo)志物。