一問(wèn)一答一世界：了解微生物擴(kuò)增子測(cè)序

發(fā)稿時(shí)間：2016-07-19來(lái)源：天昊生物

Q1:哪些樣品可以進(jìn)行微生物多樣性檢測(cè)？

A:根據(jù)微生態(tài)的類(lèi)型不同，擴(kuò)增子測(cè)序檢測(cè)的樣品可以分為以下類(lèi)型

Q2:擴(kuò)增子測(cè)序目前可以分為哪幾種類(lèi)型？

A:目前擴(kuò)增子測(cè)序服務(wù)主要包括細(xì)菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS1區(qū)/真菌ITS2區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)/功能微生物的功能基因測(cè)序，具體類(lèi)型如下：

16S rDNA測(cè)序： 16S rRNA為核糖體的RNA的一個(gè)亞基，16S rDNA就是編碼該亞基的基因，存在于所有細(xì)菌基因組。16S rDNA大小適中，約1.5Kb左右， 16S rDNA具有10個(gè)保守區(qū)和9個(gè)高變區(qū) (V1-V9)， 其中保守區(qū)在細(xì)菌間差異不大， 高變區(qū)具有高度的特異性，因此可以通過(guò)對(duì)某個(gè)或某些高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，從而對(duì)細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析。

18S rDNA測(cè)序：18S rDNA為編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列。在結(jié)構(gòu)上分為保守區(qū)和高變區(qū)，保守區(qū)反映生物物種間的親緣關(guān)系，高變區(qū)反映物種間的差異，18S rDNA在進(jìn)化速率上相對(duì)于ITS更加保守，一般在用于種以上的物種分類(lèi)。

ITS 測(cè)序：在真核生物中，18S rDNA和28S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔序列稱(chēng)為ITS區(qū)。ITS分為兩個(gè)區(qū)域：ITS1/ITS2，ITS1位于18S和5.8S之間，ITS2位于5.8S和28S之間。ITS由于是非轉(zhuǎn)錄區(qū)，承受的選擇壓力較小，變異強(qiáng)，目前已廣泛用于種及種以下真菌分類(lèi)鑒定。

功能微生物的功能基因測(cè)序：功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到廣泛關(guān)注的一類(lèi)微生物，如硝化細(xì)菌、反硝化菌、氨氧化細(xì)菌、硫酸鹽還原菌、固氮菌、固氮菌等。每種功能微生物在分類(lèi)學(xué)上可能有很大不同，但卻具有相類(lèi)似的基因使其能夠發(fā)揮同樣的功能，因此使這些功能細(xì)菌發(fā)揮這種特定功能的基因就稱(chēng)為功能基因，如nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。功能基因測(cè)序就是針對(duì)這些功能基因設(shè)計(jì)PCR通用引物，進(jìn)行建庫(kù)高通量測(cè)序。

Q3:擴(kuò)增子測(cè)序區(qū)段如何選擇？

A: 由于選擇不同的高變區(qū)，相同菌群的分類(lèi)結(jié)果差別明顯，因此需根據(jù)文獻(xiàn)找到與您研究的微環(huán)境以及與您比較關(guān)注的菌群所用的區(qū)段，如果目前對(duì)其中菌群不是十分了解的話那么也盡量選擇類(lèi)似環(huán)境，需要詳細(xì)查找文獻(xiàn)。

Q4: 擴(kuò)增子測(cè)序是否需要設(shè)置生物學(xué)重復(fù)，如果需要多少合適？

A: 為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而且根據(jù)現(xiàn)已發(fā)表的文章，擴(kuò)增子測(cè)序都需要設(shè)置生物學(xué)重復(fù)。如果是環(huán)境樣本建議最少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，例如某一地點(diǎn)的土壤樣品需要采集3份另外，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的樣本重復(fù)數(shù)量和實(shí)驗(yàn)條件需保持一致；如果是宿主樣本建議最少20個(gè)個(gè)體，例如糞便樣本，口咽樣本，唾液樣本都至少來(lái)自20個(gè)個(gè)體。

Q5: 收集樣本時(shí)為什么需要收集相關(guān)樣本信息？

A: 因?yàn)閿U(kuò)增子測(cè)序研究目的核心包括三方面的內(nèi)容：研究樣品中的物種分類(lèi)、物種豐度以及揭示環(huán)境因子和微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，因此收集樣本時(shí)有必要收集樣品的信息，例如醫(yī)學(xué)：性別、年齡、BMI、體重、是否服用抗生素、飲食習(xí)慣、疾病史、種族、地域等指標(biāo)。農(nóng)業(yè)和環(huán)境：光照、溫度、濕度、離子濃度、PH、磷、有機(jī)碳、有機(jī)氮等指標(biāo)。

Q6: 腸道微生物研究取樣有什么注意問(wèn)題？

A: 假設(shè)您要對(duì)人體腸道微生物菌群進(jìn)行測(cè)序，一般建議采取新鮮樣品，這是因?yàn)槲⑸锉旧硎腔畹?，樣品長(zhǎng)期保存會(huì)改變?cè)芯旱臉?gòu)成；另外一般用無(wú)菌勺子取糞便中間，這是因?yàn)橥鈱訒?huì)與腸粘膜接觸，有人體脫落細(xì)胞污染；另外先排尿，避免尿液污染；另外如果寄送的是樣品而不是DNA，采樣后務(wù)必立即封存樣品冷凍保存，切忌反復(fù)凍融，送樣時(shí)使用干冰運(yùn)輸，盡量縮短保存和運(yùn)輸?shù)臅r(shí)間，謹(jǐn)防污染，盡可能地保持樣品中微生物的原始結(jié)構(gòu)。

Q7:腸道微生物研究對(duì)象的篩選標(biāo)準(zhǔn)是什么？

A: 舉個(gè)鑒定與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的腸道核心菌群的例子。

研究對(duì)象是：28份位置匹配的活檢標(biāo)本，其中包括正常腸道組織樣本，腺瘤性息肉組織樣本，腫瘤組織樣本。

研究對(duì)象的篩選標(biāo)準(zhǔn)是：

正常組：所有志愿者無(wú)特殊飲食習(xí)慣；年齡在20-60歲之間；志愿者的健康狀況由自我報(bào)告和結(jié)腸鏡檢查來(lái)判斷；志愿者均無(wú)胃腸道疾病史，無(wú)肝、膽、膜腺等消化系統(tǒng)疾病史；無(wú)手術(shù)史而且在樣本采集3個(gè)月前沒(méi)有服用抗生素。

病例組：志愿者要接受問(wèn)卷調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括年齡、性別、遺傳、飲食、藥物治療情況等。要求性別比例均衡；年齡階段盡可能一致，沒(méi)有吸煙、飲食不均衡等不良習(xí)慣；標(biāo)本收集前3個(gè)月沒(méi)有使用過(guò)各種抗生素或益生菌；沒(méi)有２年以上醜酒史；不具有代謝性疾病，如肥胖癥、糖尿病、結(jié)石、各種肝病等；不具有家族聚集性疾病。

Q8:皮膚微生物研究對(duì)象的篩選標(biāo)準(zhǔn)是什么？

A: 舉個(gè)鑒定皮膚表皮不同部位真菌差異的例子。

研究對(duì)象：十位健康成年人身上收集了容易發(fā)生真菌性皮膚病的十四個(gè)皮膚部位拭子樣本。研究對(duì)象的篩選標(biāo)準(zhǔn)是：排除包括慢性皮膚疾病的對(duì)象；前6個(gè)月不使用抗菌藥物；洗澡可以被允許，但是僅能使用非抗菌肥皂或清潔劑；收集樣本24小時(shí)前沒(méi)有洗澡。

Q9:口腔微生物研究對(duì)象的篩選標(biāo)準(zhǔn)是什么？

A: 舉個(gè)鑒定牙周炎患者不同口腔環(huán)境的微生物群落組成的例子。

研究對(duì)象：牙周炎患者和健康志愿者的唾液，牙齦上菌斑，牙齦下菌斑樣本。

研究對(duì)象的篩選標(biāo)準(zhǔn)是：患者在樣本收集前的3個(gè)月內(nèi)沒(méi)有接受牙周治療；所有參與者沒(méi)有懷孕或任何系統(tǒng)性疾?。辉谶^(guò)去的3個(gè)月內(nèi)沒(méi)有抗生素治療；至少20個(gè)牙齒在口腔內(nèi)。所有參與者在采樣3小時(shí)前不要吃喝。

Q10:現(xiàn)在是個(gè)環(huán)境樣本就能進(jìn)行微生物多樣性研究，但是怎么在前期實(shí)驗(yàn)對(duì)象組合設(shè)計(jì)上更有新意？

A: 較早微生物多樣性研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象組合只是簡(jiǎn)單的病例/對(duì)照樣本，現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)對(duì)象組合上已經(jīng)向復(fù)雜的方向發(fā)展，通過(guò)下面的表格就一目了然了。

微生物多樣性與健康

微生物多樣性與環(huán)境

 

微生物多樣性與農(nóng)業(yè)