關(guān)注功能基因擴(kuò)增子測(cè)序，了解功能微生物群落結(jié)構(gòu)

發(fā)稿時(shí)間：2016-06-27來源：天昊生物

小題目：反硝化菌功能基因擴(kuò)增子測(cè)序經(jīng)典文章解讀

所謂功能微生物就是在自然界中由于其功能的重要性而受到廣泛關(guān)注的一類微生物，如硝化細(xì)菌、反硝化菌、氨氧化細(xì)菌、硫酸鹽還原菌、固氮菌、固氮菌等。每種功能微生物在分類學(xué)上可能有很大不同，但卻具有相類似的基因使其能夠發(fā)揮同樣的功能，因此使這些功能細(xì)菌發(fā)揮這種特定功能的基因就稱為功能基因，如nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。針對(duì)這些功能基因設(shè)計(jì)PCR通用引物，進(jìn)行建庫高通量測(cè)序，可對(duì)樣本之間的功能細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并與每個(gè)采樣點(diǎn)的環(huán)境因子相結(jié)合，可以同時(shí)分析環(huán)境因子與功能細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系。下面就介紹一篇利用反硝化菌功能基因nirS進(jìn)行高通量測(cè)序技術(shù)從而比較樣本之間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的文章。

英文題目：Marine Oxygen-Deficient Zones Harbor Depauperate Denitrifying Communities Compared to Novel Genetic Diversity in Coastal Sediments

中文題目：與沿海沉積物中新的遺傳多樣性相比海洋缺氧地帶具有更貧瘠的反硝化細(xì)菌群落

期刊名：Microbial ecology       發(fā)表時(shí)間： 2015.2.28            IF：2.97

單位：麻省大學(xué)生物系

技術(shù)：nirS基因測(cè)序（約650bp）

測(cè)序平臺(tái)：Roche 454 FLX 測(cè)序平臺(tái)

材料：

        共計(jì)21個(gè)樣本，海洋缺氧區(qū)（ODZs）水樣4個(gè)阿拉伯海水樣AS和5個(gè)東部熱帶南太平洋水樣ETSP；沿海沉積物樣品：4個(gè)切薩皮克灣沉積物樣品CB和8個(gè)鹽沼地沉積物樣品MP

研究背景:

        氮，作為必不可少的營養(yǎng)素之一，在生物地球化學(xué)循環(huán)中很復(fù)雜，因?yàn)樗B接著多個(gè)水庫（大氣、海洋和土壤）和具有多個(gè)氧化還原狀態(tài)。因此，氮循環(huán)的氮在陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)于維持生態(tài)系統(tǒng)的功能是非常重要的。許多固定的氮通過污水處理系統(tǒng)和自然系統(tǒng)的反硝化作用和厭氧氨氧化兩個(gè)微生物傳導(dǎo)途徑返回到大氣中。固定的氮通過反硝化作用和厭氧氨氧化的去除對(duì)全球的氮循環(huán)十分重要。固定氮的損耗估計(jì)表明，65-75%海洋氮損耗發(fā)生在河口和大陸架沉積物中，其余的發(fā)生在三個(gè)主要的缺氧區(qū)（ODZs）：東部熱帶北部，南太平洋和阿拉伯海。在淺海沉積物中，特別是鹽沼澤沉積物中，是報(bào)道最高的區(qū)域。反硝化作用似乎是最占據(jù)主導(dǎo)地位的損耗過程，它主要是利用微生物將硝酸鹽亞硝酸鹽還原成NO，N₂O和N₂的過程，實(shí)現(xiàn)從生態(tài)系統(tǒng)中移除固定的氮，控制有限氮系統(tǒng)的主要生產(chǎn)速率。氮循環(huán)過程中催化作用的關(guān)鍵酶，包括反硝化作用和厭氧氨氧化已經(jīng)有相當(dāng)多的了解。反硝化過程中使亞硝酸還原成一氧化氮的關(guān)鍵酶編碼基因?yàn)閚irS或者nirK基因。NirS基因編碼細(xì)胞色素cd1亞硝酸還原酶，已經(jīng)有很多報(bào)道，并且在海洋系統(tǒng)中已經(jīng)有了比較。許多對(duì)環(huán)境多樣性和微生物功能研究主要集中在16S擴(kuò)增子測(cè)序，而對(duì)于特定蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序的研究幾乎沒有。本文采集了兩個(gè)ODZs區(qū)水樣（AS和ETSP）和沿海沉積物樣品(CB和MP)，采用nirS基因高通量測(cè)序技術(shù)比較兩者之間細(xì)菌群落的分布和多樣性。

研究結(jié)果：

1. NirS基因Alpha多樣性和稀釋曲線分析

經(jīng)過序列處理得到約125000條nirS序列，按95%序列相似性聚類形成OTU。所有樣品共得到1815條分類OTU。沉積物MP中特異OTU很多，單個(gè)鹽沼地達(dá)到529個(gè)OTU。總之，鹽沼地采樣點(diǎn)有著更高的物種多樣性（Chao1和ACE預(yù)估值分別達(dá)到1239和1209）。相反，海洋缺氧區(qū)ODZ樣品物種多樣性很低，每個(gè)樣品OTU都低于12，多樣性預(yù)測(cè)值低于沉積物MP樣品2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。切薩皮克灣沉積物CB物種多樣性介于兩者之間。

盡管發(fā)現(xiàn)沉積物中有更高的多樣性，但這些樣品的稀釋曲線卻沒有達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量不夠，還有相當(dāng)多的多樣性有待于進(jìn)一步采樣測(cè)序。相比之下，海洋缺氧區(qū)ODZ樣品稀釋曲線OTU數(shù)量更少，且許多樣品稀釋曲線已經(jīng)達(dá)到平緩期，顯示了高序列覆蓋度。在與硝酸鹽高去除率相關(guān)的特定環(huán)境條件下，反硝化細(xì)菌多樣性的減少顯示僅有極少數(shù)反硝化細(xì)菌在ODZs區(qū)域起移除固定氮的作用。沉積物中物種豐富度和系統(tǒng)發(fā)育高度多樣性這一現(xiàn)象，可能是由于沿海生態(tài)系統(tǒng)是海洋和陸源輸入的最終受體，因此它有著更多棲息的微生物從而使微生物的整體多樣性得到提高。

                                             

表1：取樣點(diǎn)位置信息，觀測(cè)到的OTU數(shù)量，兩個(gè)菌群豐度指數(shù)（Chao1 and Ace）和菌群多樣性指數(shù)（Shannon）

圖1：海洋沉積物（左圖）和兩個(gè)海洋缺氧區(qū)（右圖）樣品nirS基因序列的稀釋性曲線

2.  NirS基因系統(tǒng)發(fā)育分析

通過對(duì)nirS基因的OTU進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，總共得到13個(gè)分支，大多數(shù)屬于4個(gè)大的分支（5,7,8和13）。1815個(gè)nirS OTU中只有35個(gè)OTU和純培養(yǎng)的代表序列相似度大于85%。平均的序列相似度為78+3.2%，這表明產(chǎn)生了許多新的反硝化微生物。

對(duì)于每個(gè)分支，把每個(gè)棲息地的OTU的相對(duì)豐度通過畫圖表示出來。主要OTU序列只出現(xiàn)在沿海沉積物中，且只有分支13的OTUs與可培養(yǎng)的alpha變形菌序列相似度大于85%。

分支8在鹽沼地沉積物MP樣品中豐度最高的OTU（OUT 1796, 占沼澤nirS 序列的15 %），與Gamma變形菌相似度高。其次，鹽沼地沉積物中豐度次高的OTU（OUT 1800, 占沼澤nirS 序列的14%），分布在分支11中，這個(gè)OTU與beta變形菌中的Brachymonas denitrificans序列相似度為80%，數(shù)據(jù)顯示變形菌綱可能在鹽沼地沉積物去除固定氮方面發(fā)揮著重要作用。

盡管切薩皮克灣沉積物CB樣品也采自于沿海沉積物，但切薩皮克灣沉積物CB樣品細(xì)菌群落的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)與鹽沼地沉積物MP樣品細(xì)菌群落有很大的區(qū)別，CB樣品中有40%的序列隸屬于分支7的亞支，沒有可匹配于純培養(yǎng)代表序列的序列。

海洋缺氧區(qū)ODZs樣品的nirS序列系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)和沿海沉積物相比顯著變窄。阿拉伯海（AS）水樣中，有99%的序列屬于5個(gè)OTU類群（OTU1650/1570/1483/1425/1453），在ETSP水樣中，99%序列屬于4個(gè)OTU（OTU1570/1520/1487/1333）。屬于分支12最遠(yuǎn)分支的OTU1570是ODZs區(qū)域豐度最高的OTU，它在阿拉伯海AS和熱帶東太平洋ETSP樣品中分別占38%和59%，它與厭氧氨氧化細(xì)菌Scalinduas屬nirS序列相似度為92%。其余的ODZs區(qū)優(yōu)勢(shì)OUT，如OTU1650和OTU1520分別位于分支7和8，分別在AS和ETSP樣品中占42%和36%。這些序列與可培養(yǎng)代表序列的相似度低于75%，系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)更加證明了海洋缺氧區(qū)ODZs和沿海沉積物反硝化細(xì)菌群落相比是十分貧瘠的。

圖2. NirS基因的OTU系統(tǒng)發(fā)育樹。Marsh sediments：沼澤沉積物；Estuarine sediments：河口沉積物；Eastern Tropical S.Pacific ODZ : 熱帶東太平洋;  Arabian Sea ODZ：阿拉伯海

3. NirS基因Beta多樣性分析

基于weighted UniFrac的熱圖顯示樣品可以聚類于兩種，一類是ODZs區(qū)域的大部分樣品，一類是所有的沉積物樣品和兩個(gè)來自于ODZ區(qū)域的ETSP3和AS1，表明不同棲息地的反硝化細(xì)菌群落之間有著顯著差異，這個(gè)結(jié)果也通過Adonis分析結(jié)果證明。

圖3. 對(duì)nirS序列的weighted UniFrac熱圖分析。UniFrac 度量越低，就和被比較樣本的群落結(jié)構(gòu)越相似。方框中的數(shù)字代表是UniFrac 度量。ETSP：東部熱帶南太平洋地區(qū)；AS：阿拉伯海；CB：切薩皮克灣；MP： Sippewissett沼澤區(qū)

基于weighted UniFrac距離的PCoA分析進(jìn)一步證實(shí)了熱圖的聚類結(jié)果。一軸和二軸分別解釋了67%和11%的群落差異。此外可以看出8個(gè)鹽沼地樣品（MP）和ODZs的樣品隨著x軸分布分別聚類，CB樣品沿著y軸分布聚在一簇。ODZs區(qū)樣品形成一個(gè)主要類群，包括AS區(qū)3個(gè)樣品和ETSP區(qū)3個(gè)樣品。

圖4：基于weighted UniFrac距離的PCoA分析。AS：阿拉伯海； ETSP：東部熱帶南太平洋；CB：切薩皮克灣；MP：Sippewissett沼澤區(qū)；

為了進(jìn)一步研究ODZs區(qū)反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，研究者分析了每個(gè)采樣點(diǎn)的環(huán)境因子與反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系。CCA圖顯示AS和ETSP樣品分布不同，一軸和二軸解釋度分別為35%和21%。ETSP樣品聚類更明顯。發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)AS和ETSP反硝化細(xì)菌群落變異的影響最大。在CCA圖中，每個(gè)樣品后面的百分?jǐn)?shù)顯示了每個(gè)樣品中這條序列占所有序列的百分比。發(fā)現(xiàn)ETSP5樣品中這條序列百分?jǐn)?shù)更高。還發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽濃度和深度也與群落變異相關(guān)，揭示了在任何給定時(shí)間內(nèi)厭氧氨氧化或者反硝化中氮損耗過程是動(dòng)態(tài)的。

圖5：海洋缺氧區(qū)的CCA分析。每個(gè)樣品后面的百分?jǐn)?shù)顯示了每個(gè)樣品中這條序列占所有序列的百分比。

總體評(píng)價(jià)：

研究者共得到超過12500條nirS基因序列，揭示了大量的遺傳多樣性，包括1815個(gè)特別類群，絕大多數(shù)是不可培養(yǎng)的細(xì)菌類群。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)我們對(duì)生物地球化學(xué)循環(huán)途徑中潛在關(guān)鍵代謝基因多樣性的了解甚少。

和沿海沉積物中nirS基因多樣性相比，ODZs的基因多樣性顯著降低。海洋沉積物中有1776特別細(xì)菌類群，卻沒有一個(gè)單獨(dú)的反硝化細(xì)菌成為競爭優(yōu)勢(shì)種，相對(duì)應(yīng)的，兩個(gè)ODZs樣品中只有39個(gè)獨(dú)特細(xì)菌類群，99%的序列隸屬于5個(gè)或者更少的物種。ODZs樣品中的主要序列與厭氧氨氧化細(xì)菌Scalinduas屬nirS序列相似度為92%，這個(gè)序列是ODZs區(qū)域豐度最高的OTU，它在AS和ETSP樣品中分別占38%和59%，而這個(gè)序列在海洋沉積物中幾乎沒有。本研究為阿拉伯海和熱帶南太平洋地區(qū)反硝化途徑提供了強(qiáng)有力的遺傳支持。

目前，天昊生物在功能微生物功能基因的擴(kuò)增子測(cè)序方向有豐富經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)流程穩(wěn)定成熟，例如固氮基因nifH，反硝化關(guān)鍵基因nirS等，其他功能基因歡迎電話垂詢：400-065-6886