目標(biāo)區(qū)域測序在動植物研究中的應(yīng)用

發(fā)稿時間：2016-06-20來源：天昊生物

關(guān)于目標(biāo)區(qū)域測序
       目標(biāo)區(qū)域測序（Targeted Sequencing）：是目標(biāo)區(qū)域測序是指針對感興趣的目標(biāo)區(qū)域富集后進(jìn)行大規(guī)模測序。研究者可以針對自己感興趣的染色體區(qū)域或者大量的候選基因區(qū)域進(jìn)行數(shù)百個甚至上千個樣品的序列測定。
 
目標(biāo)區(qū)域測序優(yōu)勢
針對性強(qiáng)：比起全基因組水平的研究，目標(biāo)區(qū)域測序更具有針對性，可以依賴大量的前期研究成果，獲得候選染色體區(qū)域或者基于生物通路的大量候選基因。
費(fèi)用低：目標(biāo)區(qū)域測序區(qū)域較小，可對數(shù)百個樣品進(jìn)行快速測序，大大降低了研究成本。
信息量大：比起目標(biāo)區(qū)域或者候選基因單倍型標(biāo)簽SNP分型的研究策略，目標(biāo)區(qū)域測序可以完整覆蓋整個基因區(qū)域，不僅可以獲得高頻SNP的分型數(shù)據(jù)，而且還可以發(fā)現(xiàn)低頻的和個體特有的變異。
效率高：比起使用Sanger法的候選基因測序方法，基于二代測序技術(shù)的目標(biāo)區(qū)域測序更加快速、高效！
高精度：目標(biāo)區(qū)域的高測序深度保證了更準(zhǔn)確的測序結(jié)果，例如目標(biāo)區(qū)域測序的測序深度可以達(dá)到200×。
 
目標(biāo)區(qū)域測序在動植物研究中的應(yīng)用
       1.有些物種是異源四倍體物種 ，對于這種異源四倍體物種其一個基因特定位點(diǎn)最多有四種不同的等位基因，因此要準(zhǔn)確區(qū)別不同的等位基因和準(zhǔn)確確定等位基因的拷貝數(shù)在測序時相對于二倍體就需要更高的測序深度，其測序深度至少要達(dá)到48×，此時目的目的區(qū)域測序就顯示出其無可比擬的優(yōu)勢。通過對這些異源多倍體物種的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行富集捕獲測序，數(shù)據(jù)可用于群體結(jié)構(gòu)以及GWAS-QTL分析。
相應(yīng)研究案例：
       對83株四倍體栽培土豆和1株參照二倍體土豆，平均分布在基因組上807個基因，共2.1M的區(qū)間進(jìn)行富集，測序后獲得平均覆蓋深度為63×，共12.4G的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)129,156個可靠的序列變異（在外顯子1 SNP/24 bp ，在內(nèi)含子1 SNP/15 bp），這些變異含有大量罕見變異（61%的變異MAF小于 0.05），經(jīng)KASP技術(shù)驗(yàn)證有99%的一致性。利用發(fā)現(xiàn)的變異對土豆植株成熟期和塊莖肉色相關(guān)的QTL進(jìn)行GWAS分析，定位到了之前的已知QTL位點(diǎn)。主成分分析發(fā)現(xiàn)栽培土豆可以明顯聚類為五組。 參考文獻(xiàn)：A Next-Generation Sequencing Method for Genotyping-by-Sequencing of Highly Heterozygous Autotetraploid Potato. Jan G. A. M. L. Uitdewilligen et al. 2013, PloS ONE.
 
       2.針對某些物種間的保守區(qū)域進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測序，利用測序數(shù)據(jù)進(jìn)行物種分類和系統(tǒng)進(jìn)化分析，這種策略類似于利用16S rDNA/18S rDNA/ITS擴(kuò)增子測序進(jìn)行微生物群落多樣性分析或利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行品種資源鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析。
相應(yīng)研究案例：
       不同鳥類的演化仍然有爭議，利用雜交富集的定向測序技術(shù)，對198種現(xiàn)存鳥類（代表所有鳥類譜系和兩個鱷魚外群）的394個有足夠變異度的保守位點(diǎn)進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測序（Agilent定制液相芯片富集），然后基于測序數(shù)據(jù)使用貝葉斯法和最大似然分析法建立所有鳥類譜系的系統(tǒng)進(jìn)化樹。產(chǎn)生259個高質(zhì)量測序核位點(diǎn)（平均組裝長度為1523bp）共7.8 × 10⁷ 個堿基的數(shù)據(jù)量，基于這些數(shù)據(jù)使用貝葉斯法和最大似然分析法建立所有鳥類譜系的進(jìn)化樹，5個主要分支形成新鳥綱的連續(xù)姐妹類群：（1）包括夜鷹，雨燕和蜂鳥；（2）包括杜鵑，大鴇，鴿子，蕉鵑和沙雞；（3） 鶴及其親屬；（4）水鳥類群，包括潛水類、涉水類、岸灘類；（5）麝雉類（圖1）。 參考文獻(xiàn)：A comprehensive phylogeny of birds (Aves) using targeted next-generation DNA sequencing. Richard O. Prum et al. 2015, Nature.
 
       3.為了保護(hù)種質(zhì)資源，開發(fā)可靠的并且高度可變的遺傳標(biāo)記是必不可少的，對于一些基因組復(fù)雜但是遺傳標(biāo)記比較缺少的物種，過去常使用細(xì)胞器基因組進(jìn)行相關(guān)系統(tǒng)進(jìn)化研究，但是這種方法具有效率低和單親遺傳等缺點(diǎn)，因此目前高通量測序非常適合這種非模式物種的遺傳標(biāo)記開發(fā)研究，但是使用全基因組重測序?qū)@類基因組復(fù)雜物種進(jìn)行群體進(jìn)化研究實(shí)際上是代價高昂的，而目標(biāo)區(qū)域測序這種只針對某些可靠位點(diǎn)進(jìn)行深度測序的技術(shù)實(shí)際上更符合成本效益。
相應(yīng)研究案例：
       根據(jù)白皮松轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)捕獲探針，從而對48棵白皮松（每棵白皮松代表不同地理位置）上的7,849個不同基因進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，從這48棵白皮松樣本中共得到 390,910,265條 reads，所得到的數(shù)據(jù)提供了4452個基因的基因信息，共鑒定到12390個多態(tài)性位點(diǎn)（其中2163個變異位點(diǎn)的MAF > 0.1），然后通過這些位點(diǎn)揭示了雜合度和等位基因豐度的地理分布趨勢， PCA分析結(jié)果與這48棵白皮松的實(shí)際地理分布是一致的，并且指出南部樹木相對于其它區(qū)域的樹木顯示出最大的差異分化。
參考文獻(xiàn)：Targeted Capture Sequencing in Whitebark Pine Reveals Range-Wide Demographic and Adaptive Patterns Despite Challenges of a Large, Repetitive Genome.Syring JV et al. 2016,Front Plant Sci.
其它應(yīng)用展望
       4. 傳統(tǒng)方法QTL性狀粗定位鎖定大致區(qū)域后，如果區(qū)域內(nèi)沒有足夠多的分子標(biāo)記或者沒有合適的分子標(biāo)記，可使用目標(biāo)區(qū)域測序來開發(fā)分子標(biāo)記從而進(jìn)行下一步的精細(xì)定位，如果精細(xì)定位鎖定區(qū)域大小在目標(biāo)區(qū)域測序大小范圍內(nèi)可以使用目標(biāo)區(qū)域測序直接鎖定QTL關(guān)聯(lián)位點(diǎn)或基因。
       5. 混池分組分析法（BSA）已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物QTL定位的研究中，并且發(fā)現(xiàn)了QTL候選區(qū)域，因此后續(xù)可以對候選區(qū)間進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測序，獲得區(qū)域內(nèi)SNP/InDel的多態(tài)信息，聯(lián)合性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)或者連鎖分析，從而鎖定QTL關(guān)聯(lián)位點(diǎn)/基因。
       6. 全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）己經(jīng)廣泛地應(yīng)用于QTL性狀的研究當(dāng)中，并且定位出了大量顯著的SNP位點(diǎn)，然而這些標(biāo)記位點(diǎn)大部分為常見變異位點(diǎn)，因此可以通過對 GWAS 鑒定的區(qū)域進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測序，從而找到與QTL性狀緊密相關(guān)的其它新的、稀有的和可能的功能變異。
 
目標(biāo)區(qū)域測序在動植物研究中的應(yīng)用總結(jié)  
天昊生物目標(biāo)區(qū)域測序整體解決方案
 
天昊生物目標(biāo)區(qū)域測序特色

• 實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法靈活：多種策略可供選擇，適合各種規(guī)模的目標(biāo)區(qū)域二代測序項(xiàng)目。
• 極具特色的實(shí)驗(yàn)質(zhì)控體系：利用SNaPshot多重SNP分型技術(shù)對目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的12-16個高頻SNP位點(diǎn)進(jìn)行SNP分型質(zhì)控，判斷測序數(shù)據(jù)和樣品標(biāo)記的準(zhǔn)確性。
• 經(jīng)驗(yàn)豐富的生物信息學(xué)和遺傳學(xué)分析團(tuán)隊(duì)：結(jié)合多年豐富的遺傳分析經(jīng)驗(yàn)，開發(fā)了一套理論基礎(chǔ)扎實(shí)、實(shí)用性強(qiáng)的二代測序數(shù)據(jù)分析體系，為研究者更好的判斷和分析二代測序的結(jié)果提供了指導(dǎo)性的幫助。

 
天昊目標(biāo)區(qū)域測序技術(shù)發(fā)表高分文章

• Whole-exome and targeted sequencing identify ROBO1 and ROBO2 mutations as progression-related drivers inmyelodysplastic syndromes. Feng Xu,et al. Nature communication. 2015, 26;6:8806.（IF= 11.47）（應(yīng)用天昊創(chuàng)新技術(shù)：FastTarget^TM）
• Genomic variations of the mevalonate pathway in porokeratosis. Zhang Z,et al. Elife. 2015,23;4:e06322.（IF= 9.322）（應(yīng)用天昊創(chuàng)新技術(shù)：EasyTarget^?）
• Mutations in epigenetic regulators are involved in acute lymphoblastic leukemia relapse following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Xiao, H,et al.Oncotarget.2016,19;7(3):2696-708. （IF= 6.359）（應(yīng)用天昊創(chuàng)新技術(shù)：FastTarget^TM）

 
FastTarget^TM項(xiàng)目實(shí)例：
項(xiàng)目簡介：利用FastTarget^TM富集技術(shù)對32個基因(約140K區(qū)域)350個樣本進(jìn)行測序。
數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)：共測序得到37M的reads，有效34M的reads，富集效率92%，平均每個片段覆蓋173X。 分析結(jié)果：在32個基因350個樣本中共發(fā)現(xiàn)了184個突變。
數(shù)據(jù)結(jié)果驗(yàn)證：采用SNaPshot對目標(biāo)區(qū)域內(nèi)12個高頻SNP位點(diǎn)對所有樣本進(jìn)行了分析，觀察基因型的一致性，除了少部分樣本因?yàn)闇y序深度不夠，其它基本上達(dá)到了100%的一致性。  
EasyTarget^?項(xiàng)目實(shí)例
項(xiàng)目簡介：采用EasyTarget^?富集方法對 9個基因(約37K區(qū)域)133個樣本進(jìn)行測序。
數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)：總數(shù)據(jù)量為11M reads，有效reads為9.6M，富集效率87%，平均每個樣本72K reads，平均每個片段覆蓋486X，樣本測序深度分布如下。 分析結(jié)果：在9個基因133個樣本中共發(fā)現(xiàn)55個突變。
數(shù)據(jù)結(jié)果驗(yàn)證：全部通過一代Sanger測序驗(yàn)證，100%的準(zhǔn)確性。