CNV在植物研究中的案例分析2

發(fā)稿時間：2016-04-22來源：天昊生物

英文題目：Copy Number Variation of Cytokinin Oxidase Gene Tackx4 Associated with Grain Weight and Chlorophyll Content of Flag Leaf in Common Wheat
期刊名：PLOS ONE
發(fā)表日期: 2015年12月
研究背景：
       光合作用對食品和纖維生產是至關重要的，約70–90%的糧食生產來源于灌漿期的光合作用產物。在高等植物葉片中，葉綠素是葉綠體的主要光合色素，它的含量直接影響植物光合作用效率，從而影響作物產量。因此了解葉綠素生物合成和控制葉綠素含量的遺傳機制對改善作物產量至關重要。研究表明植物激素細胞分裂素（CTK）能夠顯著增加葉片葉綠素含量，葉綠體穩(wěn)定性和凈光合速率。異戊烯基轉移酶基因（IPT）過表達轉基因植株通常表現(xiàn)出持續(xù)綠色的表型，這是因為其體內的細胞分裂素（CTK）含量很高。細胞分裂素氧化酶（CKX）可以使細胞分裂素水平不可逆失活，因此細胞分裂素氧化酶可通過調控細胞分裂素含量來調控葉綠素含量和光合作用，因此細胞分裂素氧化酶基因被認為與葉綠素水平和穩(wěn)定性有緊密關系。目前很多研究關注細胞分裂素氧化酶基因與作物產量及其相關性狀的關系。在小麥中，7個Tackx基因被分離出來，包括染色體3A上的Tackx1；7A或7B上的Tackx2；3DS上的Tackx2.1 和Tackx2.2；3DS上的Tackx3，Tackx5和Tackx6；這些Tackx基因通常與小麥穗粒重或穗粒數(shù)相關，然而目前對于Tackx基因與葉綠素水平的關系還不清楚。因此本文想解決兩個問題： （1）鑒定Tackx基因變異形式以及它們與粒重和葉綠素水平的關系； （2）驗證Tackx基因對粒重和葉綠素水平的影響。
研究材料： 169株京411 ×紅芒春21的小麥重組自交系；102株小麥自然群體
研究性狀：小麥粒重；小麥開花5, 10, 15, 20, 25 天后旗葉葉綠素的含量
技術平臺： PCR
研究思路：

•        測量親本，重組自交系群體，自然群體的粒重和葉綠素水平；
•        開花后不同時期葉綠素含量和粒重的關聯(lián)性分析；
•        所有Tackx基因與葉綠素含量，粒重的關聯(lián)性分析；
•        設計所有Tackx基因的引物用來檢測其變異形式；
•        Tackx4基因變異形式與葉綠素含量及粒重的關聯(lián)性分析；
•        使用中國春小麥缺體四體系把Tackx4定位到染色體上；
•        控制葉綠素含量和粒重的QTL定位；
•        Tackx4基因變異形式和葉綠素含量，粒重的連鎖分析；
•        Tackx4基因三個拷貝的序列分析；

研究結果：
測量粒重和葉綠素水平
       以169株京411 ×紅芒春21的小麥重組自交系為研究對象，其中京411四季的平均千粒重是46.2 g，而紅芒春21的平均千粒重是20.9 g。這兩個親本在產量，旗葉葉綠素含量和粒重方面具有明顯的差異，102株的小麥自然群體在旗葉葉綠素含量和粒重方面也有明顯的差異（Table 1）。 葉綠素含量和粒重的關聯(lián)性
       小麥重組自交系群體內旗葉葉綠素含量和粒重表現(xiàn)出較大的波動（Table 1）。開花后不同時期的葉綠素含量和粒重關聯(lián)性分析表明在小麥灌漿前期旗葉葉綠素含量對于粒重有明顯影響。
Tackx基因與葉綠素含量，粒重的關聯(lián)性
       關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)在所有Tackx基因中Tackx4基因與旗葉葉綠素含量和粒重有明顯的關聯(lián)性（Table 2）。接著設計所有已分離Tackx基因的引物用來檢測它們的變異形式，結果在重組自交系群體中檢測到Tackx4基因有兩種表達模式：京411的基因型A和紅芒春211的基因型B（Fig 1），Tackx4基因的兩個片段表現(xiàn)出共分離。分析表明開花5-15天后攜帶基因型A個體的葉綠素含量和粒重要比攜帶基因型B個體的高（Table 2），這些結果說明基因型A與葉綠素含量和粒重顯著關聯(lián)。
Table 2. 重組自交系群體內Tackx4基因的兩種基因型與旗葉葉綠素含量和粒重關聯(lián)性分析 Tackx4基因的染色體定位
       以前的研究表明細胞分裂素氧化酶基因CKX屬于一個大的基因家族，主要分布在染色體3A, 3B, 3D, 7A, 7B上，本文使用中國春小麥缺體四體系把Tackx4定位到染色體上。使用引物T19-20在中國春小麥上檢測到兩個擴增片段Tackx4-2和Tackx4-3（Fig 2）, 被定義為基因型C。而從N3AT3B, N3AT3D和山羊草（DD基因組） 中則不能擴增出Tackx4基因 （Fig 2），說明Tackx4基因在普通小麥的3A染色體上。這些結果也表明使用Tackx4基因引物T19-20至少能從普通小麥中擴增出3個片段。 Tackx4和基因特異標記的連鎖分析
       為了分析Tackx4在染色體3A上的遺傳連鎖并進一步評價它對葉綠素含量和粒重表型變異的作用，挑選了染色體3A上的49個SSR markers用來區(qū)分兩個親本（京411 和紅芒春21）以及兩個池（20個高得分RIL個體和20個低得分RIL個體）。49個SSR markers中，有13個SSR markers和T19-20都展現(xiàn)出多態(tài)性，并且位于同一個連鎖群（Fig 3）。結果鑒定到一個同時控制開花5-15天旗葉葉綠素含量和粒重的基因座位，位于染色體3A markers T19-20和wmc169之間 （Fig 3）。比對到Tackx4基因上的QTL可以解釋葉綠素含量和粒重8.9%-22.3%的變化（Table 3）。
  Tackx4變異形式和葉綠素含量，粒重的連鎖分析
       為了進一步確定Tackx4不同變異形式對葉綠素含量，粒重的作用效果，對小麥自然群體（102種）進行了基因型鑒定，并分析了Tackx4基因型與粒重之間的關系。在這102個小麥品種中，有49種攜帶基因型A，15種攜帶基因型B，38種攜帶基因型C（Fig 4）?；蛐秃托誀畹倪B鎖分析表明葉綠素含量（C5, C10, C15），粒重與基因型A呈正相關，但是與基因型B和C 呈負相關（Table 4）。 Tackx4 三個拷貝的序列分析
       對Tackx4-1, Tackx4-2, Tackx4-3 進行測序分析。這3個片段與Tackx4（BM138354）（在本次研究中用于設計引物T19-20）有超過99%的同源性，并且片段相互之間也超過98%的同源（Figs 5, 6）。這些結果表明Tackx4（BM138354）實際上是這3個片段中的一個。Tackx4 三個拷貝的序列差異主要位于262bp -378bp的內含子區(qū)域，它有明顯的內含子-外顯子邊界序列“GT/AG”。在這個內含子中發(fā)現(xiàn)了2個8-bp的插入和一個“AAA-TTT”變異，另外在外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了數(shù)個SNP位點（Figs 5）。