單菌基因組測序服務(wù)：準(zhǔn)確、高效就在天昊!

發(fā)稿時間：2016-03-08來源：天昊生物

1. 1.    服務(wù)介紹

       細(xì)菌/真菌廣泛存在于大自然中，其具有多樣性豐富，基因組較小等特征。其中細(xì)菌是一類只存在擬核的裸露DNA的單細(xì)胞原核生物（基因組大小一般小于10Mb），它包括真細(xì)菌和古生菌兩大類群，根據(jù)其基本形態(tài)可分為球菌，桿菌，螺旋菌，根據(jù)細(xì)胞壁組成成分，又分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，大多數(shù)化膿性細(xì)菌屬于革蘭氏陽性菌，它們能產(chǎn)生外毒素使人致病；而大多數(shù)腸道菌則屬于革蘭氏陰性菌，它們能產(chǎn)生內(nèi)毒素使人致病。常見的革蘭氏陽性菌有葡萄球菌，鏈球菌，肺炎雙球菌，破傷風(fēng)桿菌等；常見的革蘭氏陰性菌有痢疾桿菌，傷寒桿菌，大腸桿菌，變形桿菌等。 細(xì)菌對人類既有用處又有危害，一方面細(xì)菌是某些疾病的病原體，可導(dǎo)致傷寒、肺炎等疾病，另一方面，人類也常利用細(xì)菌制作乳酪及酸奶等。真菌則是一種低等真核生物（基因組大小約為2.5 Mb-100Mb），復(fù)雜度介于細(xì)菌和動植物之間，最常見的真菌是各類蕈類，霉菌和酵母。真菌門可分為擔(dān)子菌亞門，子囊菌亞門，半知菌亞門等，其中擔(dān)子菌亞門包含許多具有食用和藥用價值的有益真菌，如銀耳、金針菇、靈芝等，半知菌亞門則包含許多對農(nóng)作物和森林致病的病原菌，如稻瘟病菌。
       隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，測序成本大幅降低使得獲得具有簡單基因組的細(xì)菌/真菌基因組信息更加便捷，獲得某個細(xì)菌/真菌基因組信息，不但可以幫助了解其表型特征，致病機(jī)制以及其重要相關(guān)基因的功能，還可以通過和其它細(xì)菌/真菌基因組信息進(jìn)行比對分析和進(jìn)化分析，從而了解其分子進(jìn)化機(jī)制。根據(jù)不同的研究目的和需求，細(xì)菌/真菌基因組測序又包括細(xì)菌/真菌de novo測序（框架圖、精細(xì)圖、完成圖）和細(xì)菌/真菌重測序，進(jìn)一步可以細(xì)分為如下5個產(chǎn)品：
       細(xì)菌/真菌框架圖：采用小片段建庫，HiSeq深度測序和初步的基因組組裝策略，性價比高，滿足細(xì)菌/真菌基因組研究基本需求。
       細(xì)菌/真菌精細(xì)圖：采用大片段加小片段建庫，二代加三代測序和反復(fù)優(yōu)化的基因組聯(lián)合組裝策略，是目前研究細(xì)菌/真菌基因組的主流技術(shù)。
       細(xì)菌完成圖：綜合利用一代二代甚至三代測序技術(shù)，根據(jù)菌株具體情況制定最優(yōu)策略，最終得到一條完整的基因組序列（1 Contig，0 gaps），是細(xì)菌基因組測序組裝的最高要求。
       真菌完成圖：綜合利用二代、三代測序技術(shù)，以及光學(xué)圖譜 (OM) 技術(shù)，根據(jù)菌株具體情況制定最優(yōu)策略，最終得到真菌的完成圖 (scaffold_num = chr_num)，是真菌基因組測序組裝的最新要求。
       細(xì)菌/真菌重測序：針對已知基因組序列的細(xì)菌/真菌，采用小片段建庫，HiSeq深度測序，后續(xù)分析不依賴于組裝，關(guān)注基因組變異情況（包括SNP和InDel等），是群體研究的首選。

1. 2.    技術(shù)優(yōu)勢

1.        A.    測序方案靈活：根據(jù)待測菌株定制最優(yōu)策略，綜合利用一代二代三代測序技術(shù)
2.        B.    分析團(tuán)隊強(qiáng)大：擁有強(qiáng)大的生物信息團(tuán)隊，分析內(nèi)容全面，并提供個性化分析
3.        C.    實驗體系嚴(yán)格：從DNA抽提，質(zhì)檢到文庫構(gòu)建，上機(jī)測序有嚴(yán)格的實驗流程

 

1. 3.    技術(shù)參數(shù)

1. 4.    服務(wù)流程

1.        A.    建庫測序流程

1.        B.    數(shù)據(jù)分析流程

1. 5.    經(jīng)典文章解讀

案例1：腸球菌Enterococcus faecium TX16的全基因組測序及比較分析

背景：在歐美國家，腸球菌是醫(yī)院獲得性感染（hospital-acquired infections）的主要原因，其中Enterococcus faecalis和 Enterococcus faecium是導(dǎo)致腸球菌感染的兩種最常見菌株。過去十年中，由E. faecium菌株引起腸球菌感染的比例不斷上升。雖然在醫(yī)院環(huán)境中E. faecium逐漸取代E. faecalis的機(jī)制并不清楚，但許多基因型鑒定和系統(tǒng)生物學(xué)研究已經(jīng)指出了多種E. faecium菌株在全球臨床環(huán)境中的廣泛傳播。然而，E. faecium完整基因組的缺失成為系統(tǒng)研究E. faecium分子流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)制的主要障礙。

方法：在本研究中，首次對E. faecium菌株TX16（隸屬于ST18家族）進(jìn)行了全基因組測序。隨后將TX16的全基因組與21個E. faecium菌株基因組草圖（未完全測通）進(jìn)行了比對，通過系統(tǒng)生物學(xué)，多位點序列分析和基因相似性分析，并對ORFs、多種基因和信號通路進(jìn)行了分析。

結(jié)果：

1.        1)    獲得了E. faecium菌株TX16 的全基因組圖譜，TX16基因組包含2,703個編碼蛋白的ORFs、62個tRNA、6拷貝的核糖體rRNA 和32個非編碼RNA。
2.        2)   通過系統(tǒng)生物學(xué)，多位點序列分析和基因相似性分析，找到了醫(yī)院相關(guān)菌株（HA）（hospital-associated strains，包含STs16、STs17、STs18、STs78家族），成功將HA菌株與非醫(yī)院來源的CA菌株（community-associated）區(qū)分開來，HA菌株和CA菌株的核心基因組平均有3-4%的核苷酸序列差異。
3.        3)   菌株TX16的378個ORFs在HA菌株中特異存在。大部份是轉(zhuǎn)座子相關(guān)基因、轉(zhuǎn)運蛋白基因、噬菌體基因。
4.        4)   TX16基因組中找到9個與致病性相關(guān)的基因組島（GIs）。
5.        5)   耐抗生素基因在HA菌株中大量富集。
6.        6)   移動因子（如IS16和轉(zhuǎn)座子）也幾乎是HA菌株獨有的。

 
      參考文獻(xiàn)：Xiang Qin, et al. Complete genome sequence of Enterococcus faecium strain TX16 and comparative genomic analysis of Enterococcus faecium genomes. BMC Microbiology 2012, 12:135.

案例2：全基因組重測序揭示肌球蛋白-5的突變引起禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯的抗性

背景：小麥赤霉病是由禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）引起的一種重要病害，該病給小麥的產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失。氰烯菌酯是一種新型殺菌劑，它能強(qiáng)烈抑制禾谷鐮孢菌，但禾谷鐮孢菌在選擇壓下易對氰烯菌酯產(chǎn)生抗性。因此了解禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯的抗性機(jī)制就變得很重要，這將有助于對小麥赤霉病進(jìn)行有效控制。

方法：為了探明禾谷鐮孢菌對殺菌劑氰烯菌酯產(chǎn)生抗性的機(jī)制，以禾谷鐮刀菌標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)H-1作為參考，對抗氰烯菌酯菌株YP-1進(jìn)行重測序（115×，99.35%  coverage)，通過和PH-1序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)抗氰烯菌酯菌株YP-1的突變基因，然后針對這些突變基因在更多的抗性菌株中進(jìn)行目標(biāo)測序，從而確定影響氰烯菌酯抗性的位點，接著通過抗性實驗確定導(dǎo)致對氰烯菌酯產(chǎn)生抗性的具體功能位點。

結(jié)果：

1.        1)    通過和標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)H-1序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)含有1989個SNP的抗氰烯菌酯菌株YP-1在132個基因上有氨基酸突變。
2.        2)   在這132個發(fā)生氨基酸突變的基因中只有22個基因是在禾谷鐮孢菌數(shù)據(jù)庫中已知的。然后對氰烯菌酯敏感菌株2021和6個抗性菌株YP-1、Y2021A、B、C、D和F的這22個基因進(jìn)行測序，結(jié)果只有肌球蛋白-5在所有抗性菌株中有點突變（肌球蛋白-5基因序列的216、217、418、420和786位點核苷酸發(fā)生改變）。
3.        3)   為了證實肌球蛋白-5基因點突變是否真的引起對氰烯菌酯抗性，在抗性菌株YP-1，氰烯菌酯敏感菌株2021通過同源雙交換技術(shù)交換肌球蛋白-5基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入一個拷貝抗性片段就能引起對氰烯菌酯抗性，導(dǎo)入一個拷貝感性片段就能引起對氰烯菌酯感性。
4.        4)   氰烯菌酯抗性實驗證明216、217、418和420位點突變能導(dǎo)致禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯產(chǎn)生抗性，而786位點突變則不能導(dǎo)致禾谷鐮孢菌對氰烯菌酯的抗性。

 

     
   
   
參考文獻(xiàn)： Zheng ZT, et al. Whole-genome sequencing reveals that mutationsinmyosin-5 confer resistanceto the fungicide phenamacril in Fusarium graminearum. Scientific Reports 2015, 5: 8248.