天昊生物助力客戶解析多個物種的線粒體&葉綠體

發(fā)稿時間：2016-01-21來源：天昊生物

  在剛剛過去的2015年，天昊生物參與解析了多個物種的線粒體&葉綠體基因組，這其中包括多個動物物種的線粒體基因組（例如樹形拱肩網(wǎng)蛾，短角異斑腿蝗）和多個植物物種的葉綠體基因組（例如藥用植物盾葉薯蕷，樹參等；草本植物萬年青，白掌，掌葉大黃；觀賞植物梳唇石斛）。這些工作不僅有助于獲得多個動植物物種線粒體和葉綠體基因組序列，同時有助于進(jìn)行多個近源物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究，并且可以為后續(xù)利用基因工程來改良作物的產(chǎn)量和重要化合物的含量提供理論依據(jù)。下面我們就由淺入深了解一下動植物線粒體&葉綠體基因組測序的相關(guān)知識以及動植物線粒體&葉綠體基因組測序經(jīng)典文章。
 
技術(shù)簡介
          真核生物有兩套遺傳體系，即核基因組和細(xì)胞器基因組，動植物中的線粒體基因組，植物中的葉綠體基因組都是細(xì)胞器基因組。雖然線粒體和葉綠體有自己的遺傳物質(zhì)DNA及遺傳信息傳遞和表達(dá)系統(tǒng)（RNA、核糖體等），并且能合成自己的部分蛋白質(zhì)，但葉綠體和線粒體的蛋白質(zhì)有一部分是細(xì)胞核基因控制，在細(xì)胞質(zhì)的核糖體上合成，所以線粒體和葉綠體是半自主性細(xì)胞器。線粒體與葉綠體都是細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行能量轉(zhuǎn)換的場所，線粒體是細(xì)胞中制造能量的細(xì)胞器，葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器。
        總之，線粒體DNA（mtDNA）因其獨(dú)有的母系遺傳模式和較高的突變頻率， 已被廣泛用于生物進(jìn)化，群體結(jié)構(gòu)，疾病診斷，法醫(yī)等方面的研究。而葉綠體DNA（cpDNA）在揭示物種起源、生物進(jìn)化及不同物種之間的親緣關(guān)系等方面也具有很重要的作用。而二代測序可以簡便快速、高通量獲得線粒體/葉綠體DNA 序列信息，因此在進(jìn)化生物學(xué)，疾病診斷和法醫(yī)上具有十分重要的意義。
 
測序方案

測序方案	樣本要求	測序方式	數(shù)據(jù)要求	優(yōu)勢	特點(diǎn)
對Total DNA樣品進(jìn)行測序	類型：無降解，無污染的DNA 總量：>4μg 濃度：>50ng/μL； 純度：OD260/280=1.7-2.0	Hiseq 2×150	Q30>80% 2G data	樣本要求低 實(shí)驗(yàn)流程簡單 實(shí)驗(yàn)周期短	適用于有參考基因組的物種，在分析環(huán)節(jié)可將核DNA剔除。
對線粒體/葉綠體富集后的DNA樣品進(jìn)行測序	類型：無降解，無污染的新鮮組織 總量：>1-5g	Hiseq 2×150	Q30>80% 線粒體：20M data 葉綠體：300M data	總數(shù)據(jù)量低 有效數(shù)據(jù)量高 分析難度低	適用于目標(biāo)物種沒有參考基因組，在分析環(huán)節(jié)可降低難度。

 
生物信息分析
線粒體生物信息分析

• 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭序列及低質(zhì)量reads的處理
• 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估
• 將測序數(shù)據(jù)和參考基因組序列進(jìn)行比對，去除核基因組序列
• 線粒體基因組組裝拼接
• 統(tǒng)計(jì)線粒體A/G/C/T 含量，AT 含量
• 對線粒體基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行注釋（蛋白編碼基因、編碼tRNA、rRNA 基因），包括基因大小、起始和終止密碼子分布統(tǒng)計(jì)
• 通過和其它已測序物種的線粒體蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹
• 繪制線粒體基因組圈圖
• 序列上傳
• 其他個性化分析

 
葉綠體基因組信息分析

• 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭序列及低質(zhì)量reads的處理
• 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估
• 將測序數(shù)據(jù)和參考基因組序列進(jìn)行比對，去除核基因組序列
• 葉綠體基因組組裝拼接
• 分析葉綠體4 個特征區(qū)段（IRA 、IRB、LSC、SSC）
• 統(tǒng)計(jì)葉綠體A/G/C/T 含量，AT 含量
• 對葉綠體基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行注釋（蛋白編碼基因、編碼tRNA、rRNA 基因）
• 繪制葉綠體基因組圈圖
• 通過和其它已測序的物種葉綠體蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹
• 序列上傳
• 其他個性化分析
   

文獻(xiàn)解析
文章1:中國地方性蝗蟲牯嶺腹露蝗的線粒體全基因組測序
背景： 昆蟲線粒體DNA（mtDNA）是一個典型的大小在14-18Kb，編碼37個基因的環(huán)型分子。最近，高通量測序已成為一種獲得線粒體基因組DNA的新方法，這種快速高效的技術(shù)不僅有利于線粒體基因組的系統(tǒng)構(gòu)建，也推動了關(guān)于大量物種線粒體基因組文章的發(fā)表。牯嶺腹露蝗是最常見的，并廣泛分布在中國的一種地方性蝗蟲，它能夠?qū)χ袊矫珯魏陀衩自斐蓢?yán)重破壞，當(dāng)這兩種植物不足時，它也會危害高粱、小麥和大米。牯嶺腹露蝗的線粒體部分基因序列已被報(bào)到，但完整的線粒體基因組序列仍然沒有被公布。
目的：利用高通量測序技術(shù)分析牯嶺腹露蝗完整的線粒體基因組序列， 這將有助于補(bǔ)充蝗科昆蟲完整線粒體基因組數(shù)據(jù)。
參考序列：北極翹尾蝗線粒體序列
結(jié)果：

1. 1. 發(fā)現(xiàn)牯嶺腹露蝗線粒體基因組大小為15,655bp，在大多數(shù)昆蟲的大小范圍內(nèi)。
2. 2. 發(fā)現(xiàn)其核苷酸組成是不對稱的(A: 42.8%, C: 14.2%, G: 10.5%，T:32.6%)，整個基因組的A+T含量為75.4%。
3. 3. 序列編碼37個典型基因（13個蛋白質(zhì)編碼基因，22個tRNA基因和2個rRNA基因）以及A+T富集區(qū)。
4. 4. 有11,193bp在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，1472bp在tRNA，1314bp在大rRNA，851bp在小rRNA，777bp在 A+T富集區(qū)域。
5. 5. 所有蛋白質(zhì)編碼基因以ATN作為起始密碼子，同時它們中的大多數(shù)也以TAA作為終止密碼子，但有兩個例外情況使用TAG作為終止密碼子（COX1和ND1）。
6. 6. 22個 tRNAs大小在64-71bp，并且它們大多數(shù)在主鏈上。
7. 7. A+T富集區(qū)域位于小rRNA和tRNA-Ile之間，這個區(qū)域的GC含量為13.8%。
8. 8. 通過把測序數(shù)據(jù)中的COX1序列與先前報(bào)道的牯嶺腹露蝗COX1序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)兩者有98.8%相似度，這表明測序得到的數(shù)據(jù)可以代表牯嶺腹露蝗的線粒體基因組序列。

  參考文獻(xiàn)： Yang R, Guan L, Xu SQ. Complete mitochondrial genome of the Chinese endemic grasshopper Fruhstorferiola kulinga (Orthoptera: Acrididae: Podismini). Mitochondrial DNA. 2015, 29:1-2.
 
文章2：常綠植物樹參的葉綠體全基因組測序
背景：樹參是五加科常綠喬木或灌木物種，分布在中國，柬埔寨，老撾，泰國和越南。樹參因具有重要的藥用價值而廣泛地受到人們的關(guān)注。葉綠體因基因組小, 編碼區(qū)及非編碼區(qū)進(jìn)化速率的差異而越來越多地被用于系統(tǒng)發(fā)育研究；而且利用葉綠體基因工程來改良作物的產(chǎn)量及重要化合物的含量具有重要意義。
目的：利用高通量測序技術(shù)分析樹參的葉綠體基因組序列
參考序列：西伯利亞人參刺五加葉綠體序列
結(jié)果：

1. 1. 發(fā)現(xiàn)環(huán)形基因組的大小是156,687 bp。
2. 2. 包含一對反向重復(fù)序列（IR）（每個大小為25880 bp），一個大的單拷貝（LSC）區(qū)域（大小為86680 bp）和一個小的單拷貝（SSC）區(qū)域（大小為18247 bp）。
3. 3. 葉綠體基因組包含134個基因，其中89個蛋白質(zhì)編碼基因(81個PCG 類型)，8個核糖體RNA基因(4個rRNA類型)，和37個轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 基因(30個tRNA類型)。
4. 4. 在這些基因中， 16個基因有一個內(nèi)含子， 2個基因有一對內(nèi)含子。
5. 5. 絕大多數(shù)基因類型有一個拷貝，而同時19個基因類型有兩個拷貝。
6. 6. 所有這19個基因型包含所有的rRNA 類型（4.5S, 5S, 16S，23S rRNA）, 7個tRNA 類型（tRNA-Ala ^(UGC) , -Arg ^(ACG) ,-Asn ^(GUU) , -His ^(CAU) , -Ile ^(GAU) , -Leu ^(CAA) & -Val ^(GAC) ), 8個PCG類型（ndhB, rpl2, rpl23, rps7, rps12, ycf1,ycf2, ycf15），并且這19個基因類型都位于反向重復(fù)序列（IR）區(qū)域內(nèi)。
7. 7. 總的來說，核苷酸組成是非對稱的(30.7% A, 19.3% C, 18.7% G, 31.3% T)，整個基因組的A+T含量為62%， LSC，SSC和IR區(qū)域的A+T含量分別為63.8%, 68.0% and 56.9%。

參考文獻(xiàn)：Wang L, Du XJ, Li XF. The complete chloroplast genome sequence of the evergreen plant Dendropanax dentiger (Araliaceae). Mitochondrial DNA. 2015, 14:1-2.